论文部分内容阅读
食源ACE抑制肽因具有降血压效果明显、低毒副作用等优点,目前已成为降血压药物研究的热点之一。本文利用酶法制备甜高粱ACE抑制肽,以酶解产物对ACE的抑制率为评价指标,筛选出适宜的水解蛋白酶;通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、Box-Behnken中心组合试验优化甜高粱蛋白水解工艺;研究甜高粱蛋白酶解的可控动力学模型;通过超滤、离子交换树脂、凝胶层析分离纯化甜高粱ACE抑制肽,并对其结构进行表征。 试验结果表明,甜高粱中粗蛋白含量为13.27％,其中,疏水性氨基酸含量为37.92%,表明甜高粱蛋白是制备ACE抑制肽的理想蛋白原料。差示扫描量热分析表明,甜高粱蛋白的热变性温度为62.78℃。 从Alcalase、α-胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶四种蛋白酶中筛选出Alcalase作为制备甜高粱ACE抑制肽的水解用酶,通过Plackett-Burman试验得出影响酶解产物ACE抑制活性的重要因素为温度、pH和加酶量。经最陡爬坡试验、Box-Behnken中心组合试验确定最优工艺条件为:pH8.0、酶解温度56℃、加酶量5200U/g。 通过Alcalase可控酶解甜高粱蛋白,得到水解速率R关于初始底物浓度S0,初始酶浓度E0和水解度DH的动力学模型为:R=(50.103E0-0.4234)exp[-0.206(DH)];水解度DH关于初始底物浓度S0,初始酶浓度E0和水解时间t的动力学模型为:DH=4.854ln[1+(10.321E0/S0-0.087)t]。利用本模型制备的甜高粱ACE抑制肽具有良好的酸、碱、热稳定性和耐肠道酶消化能力。 甜高粱蛋白酶解产物经超滤分离后,各组分的体外ACE抑制活性从高到低依次为:<1kDa组分(IC50=0.116mg/mL)、1～5kDa组分(IC50=0.305mg/mL)、5~10kDa组分(IC50=1.012mg/mL)和>10kDa组分(IC50=1.225mg/mL)。Lineweaver-Burk曲线揭示出<1kDa组分和1～5kDa组分对ACE均呈现竞争性抑制,5~10kDa组分和>10kDa组分对ACE均呈现非竞争性抑制。将甜高粱ACE抑制肽依次经732阳离子交换树脂,SephadexG-50凝胶和SephadexG-15凝胶分离纯化,得到高活性的ACE抑制肽Ⅰb-2。经LC-MS/MS分析,确立了Ⅰb-2中含量和活性最高的肽链氨基酸序列为Thr-Ile-Ser或Thr-Leu-Ser。