核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary]引起的菌核病是一种世界性分布的病害。这种真菌产生的草酸(oxalic acid, OA)在其致病过程中起着决定因子的作用。盾壳霉(Coniothyrium minitans)是核盘菌的一种重寄生真菌和生防菌。前期研究表明：OA对盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发具有抑制作用；另一方面盾壳霉具有降解OA的能力,从而解除OA对其的毒害。在盾壳霉菌丝提取物中检测到草酸脱羧酶(Oxalate decarboxylase, OXDC)活性,暗示OXDC可能参与盾壳霉降解OA。但对于盾壳霉OXDC基因及其表达模式,对于OXDC基因在盾壳霉重寄生作用和抗生作用中的重要性等问题缺乏了解。针对这些问题,本研究采用同源扩增、RACE技术和反向PCR技术从盾壳霉基因组中克隆OXDC基因,采用基因敲除和互补技术对所获得的两个OXDC基因(Cmoxdc1和Cmoxdc2)进行功能分析,最后对Cmoxdc1和Cmoxdc2在盾壳霉重寄生及产生抗真菌物质(Antifungal substances, AFS)中的作用进行了分析。取得的以下研究结果：首先,从盾壳霉野生菌株Chy-1中克隆得到两个草酸脱羧酶基因,分别命名为Cmoxdc1(GenBank登录号：JF718548)和Cmoxdc2(GenBank登录号：JF718549)以及它们的启动子序列。Cmoxdc1全长1587bp,包含3个内含子和4个外显子。外显子编码477个氨基酸。Cmoxdc2全长1496bp,包含5个内含子和6个外显子,外显子编码408个氨基酸。通过Southern杂交分析,Cmoxdc1和Cmoxdc2在盾壳霉基因组中均为单拷贝基因。通过对Cmoxdc1和Cmoxdc2编码的蛋白质CMOXDC1和CMOXDC2氨基酸序列进行分析,表明CMOXDC1和CMOXDC2序列中均含有真菌OXDC保守的bicupin结构域和Mn2+活性结合位点。系统进化分析结果显示：CMOXDC1和CMOXDC2位于两个不同的分支,但均与小麦颖枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)的两个OXDCs亲缘关系最近。第二,明确了OA和pH值对Cmoxdc1和Cmoxdc2表达的影响。Cmoxdc1的表达量随着OA浓度(2～24mM)的升高(pH值下降)而升高；在pH值范围为3～8时,Cmoxdc1的表达量在pH值为3时最高,随pH升高而降低,在pH8条件下Cmoxdc1的表达量最低,仅为pH3表达量的0.05%。说明Cmoxdc1受低pH诱导。Cmoxdc2表达不受OA浓度(2～24mM)的影响,在pH值范围为3～8时,Cmoxdc2在pH值为5时表达量最高。第三,分别获得了Cmoxdc1的敲除突变体CCmoxdc1-195和ΔCmoxdc1-198,以及Cmoxdc2的敲除突变体ΔCmoxdc2-23,并对这些敲除突变体中的缺陷基因分别进行了互补,分别得到了互补转化子ACmoxxdc1-195C、ACmoxdc1-198C和ΔCmoxdc2-23C。各突变体在PDA平板上均能正常生长及产孢(20℃)。生长速率和产孢量与野生型菌株差异不大。但在含有4mM和8mMOA的PDA平板上(含0.01%溴酚蓝),突变体ΔCmoxd1-195和ΔCmoxd1-198生长缓慢,培养基没有变成蓝色,暗示pH值低,而突变体ΔCmoxd1-198、ΔCmoxd1-195C、ΔCmoxdc2-23和ΔCmoxdc2-23C生长速率则与野生型菌株没有明显差异,培养基由黄色变成蓝色,暗示pH值高。在含有16mM OA的PDA平板上,各突变体及野生型菌株均不能生长。可见,敲除Cmoxdc1导致盾壳霉耐受OA的能力下降,而敲除Cmoxdc2对盾壳霉耐受OA没有影响。在含OA(8mM和16mM)的PDB培养基中震荡培养(20℃,150rpm,12d)时,突变体ΔCmoxdc1-195和ΔCmoxdc1-198的生物量、培养基pH和残存OA量与野生型菌株显著差异(P<0.05)。突变体ΔCmoxdc1-195和ΔCmoxdc1-198的生物量与野生型相比下降了20～37%,培养液最终pH值为3.5～4.4,OA降解率仅为60%。而互补转化子ΔCmoxdc1-195C和ΔCmoxdc1-198C及野生型对OA的降解率达到90%以上。突变体ΔCmoxdc2-23和互补转化子ΔCmoxdc2-23C在含OA的PDB培养液中菌丝生物量、培养液最终pH值及OA降解率与野生型均没有显著差异(P>0.05)。可见,Cmoxdc1在盾壳霉降解OA中起部分作用,而Cmoxdc2在盾壳霉降解OA中不起作用。第四,明确了Cmoxdc1和Cmoxdc2对盾壳霉重寄生作用的影响及其机制。在重寄生作用方面,Cmoxdc1敲除突变体对正常分泌OA的核盘菌菌株A5菌落的侵染能力明显低于其互补转化子及野生型,而对草酸分泌缺陷的核盘菌菌株PB菌落的侵染能力与其互补转化子及野生型菌株没有差别。Cmoxdc2敲除突变体对菌株A5和PB菌落的寄生能力与其互补转化子及野生型菌株没有差异。可见,Cmoxdc1在盾壳霉寄生核盘菌菌丝中起着重要作用,而Cmoxdc2对盾壳霉寄生核盘菌菌丝没有影响。对核盘菌菌核寄生的结果表明：Cmoxdc1敲除突变体、Cmoxdc2敲除突变体及其互补转化子均能寄生核盘菌菌核。其寄生致腐指数与野生菌株没有显著差异(P>0.05)。原因在于菌核组织中OA浓度极低(0.08mgOA/g菌核,约为0.01mM)。为了明确Cmoxdc1在盾壳霉寄生核盘菌菌丝中的作用,研究了在OA存在及OA不存在的情况下各盾壳霉突变体及野生型菌株几丁质酶基因(Cmch1)和p-1,3-葡聚糖酶基因(Cmg1)的表达,以及胞外蛋白酶的产生。结果表明：在OA存在的情况下,Cmoxdc1敲除突变体的Cmch1和cmg1基因表达,以及胞外蛋白酶的产生受到明显抑制。第五,明确了Cmoxdc1与盾壳霉产生AFS的关系。通过比较Cmoxdc1敲除突变体、Cmoxdc2敲除突变体、互补转化子及野生型在含有OA的PDB培养基中产生AFS的能力,结果表明：Cmoxdc1敲除突变体不能完全降解OA,培养物pn值始终维持在酸性水平,培养物滤液抑制核盘菌生长并抑制核盘菌侵染油菜叶片组织的效果显著(P<0.05)高于其它突变体及野生型。由此推知：Cmoxdc1敲除突变体产生AFS的能力显著提高。根据上述结果,可以看出Cmoxdc1在盾壳霉与核盘菌互作中扮演着重要角色。一方面盾壳霉利用OA营造的酸性环境产生AFS,并表达cmoxdc1,导致OA被降解。另一方面,随着OA被分解,导致环境pH值升高,促使盾壳霉表达重寄生相关基因(cmch1、Cmg1和胞外蛋白酶基因),从而有利于盾壳霉寄生核盘菌。