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目的:作为听觉传导通路的第一级神经元,螺旋神经元(spiral ganglion neuron)接受来自脑干听觉核团——橄榄耳蜗核的外侧橄榄耳蜗传出系统神经纤维的支配和调控(GABA是其主要神经递质),同时接受来自颈交感神经节(颈上神经节和星状神经节)的纤维支配(Noradrenaline是其主要神经递质),但来自交感系统的纤维对耳蜗SGN电活动的调控机制尚不清楚。本课题主要研究交感纤维神经递质Noradrenaline对GABA在SGN诱发电流的影响及其胞内机制,以探讨交感系统调控SGN电活动进而调控听觉的可能机制。方法:1体外培养SGN细胞并进行形态和生理特性鉴定对出生后0～5d的SD大鼠的螺旋神经节细胞进行酶解分离与培养。用荧光倒置相差显微镜观察培养SGN细胞的活力以及生长与分化过程。应用免疫荧光染色方法对SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。建立穿孔膜片钳记录SGN电生理的技术方法并记录SGN基本电生理特性。2 NA对GABA诱发SGN电流的作用利用穿孔膜片钳技术,观察去甲肾上腺素(Noradrenaline, NA)对培养SGN GABA诱发电流的作用,以及介导NA调控SGN GABA电流的肾上腺素受体和NA调控SGN GABA电流的胞内分子机制。结果:1新生SD大鼠SGN在酶解分离、体外培养条件下,可获得良好的细胞形态及表形分化,表现出稳定的神经元可塑性。本培养条件下细胞可存活7～10d。接种6h后,部分细胞贴壁,有少部分细胞可见小突起,培养12 h后贴壁完成并过渡为极性细胞,l8h后贴壁的SGN细胞多呈椭圆形,胞膜清晰、胞浆匀质、折光性好,胞体透明,周围有明显的光晕。24h后,大多数SGN呈双极神经元形态,胞体两极伸出神经元突起,长的达胞体的4～5倍,短的达胞体的2～4倍。SGN可以直接贴附于多聚赖氨酸基质表面生长,亦可附着在成纤维细胞形成的单层细胞“毯”的表面生长。48～72h后细胞进一步分化,神经细胞突起可为胞体的7～8倍。7d后细胞逐渐退变直至凋亡。除神经细胞外,胶质细胞、雪旺细胞多呈扁平、多角形或长梭形,比神经细胞胞体大,胞膜不清晰,无光晕。NeuN免疫细胞化学染色,SGN全细胞着色,呈绿色,椭圆形胞体和神经突起十分清晰,表明具有神经元的特征。2 NA可逆性抑制GABA在培养SGN细胞上诱发的电流反应,这种抑制作用具有浓度依赖型,且不影响GABA的反转电位和GABA与其受体的亲和力。α1肾上腺素受体拮抗剂哌唑嗪(Pra),能轻微阻断NA对IGABA的抑制效应,α2肾上腺素受体激动剂可乐定(Clo)和拮抗剂育亨宾(Yoh)能分别模拟和阻断NA对GABA的作用。而β肾上腺素受体激动剂异丙肾上腺素(Iso),不能模拟NA对IGABA的抑制效应。百日咳毒素(IAP)敏感的G蛋白参与了NA对SGN IGABA抑制性调控。NA对SGN IGABA的抑制作用是由蛋白激酶A(PKA)相关的胞内信号转导机制介导的,蛋白激酶A抑制剂H-89能模拟NA对GABA的作用,在加入cAMP和蛋白激酶A激动剂时NA对IGABA的作用消失,但是在加入蛋白激酶C的激动剂PMA和抑制剂白屈菜赤碱(Che)时的,NA仍可抑制SGN IGABA。结论1培养新生大鼠SGN细胞的方法可获得良好状态的SGN细胞,SGN存活细胞的数量和周期可以满足体外穿孔膜片钳电生理实验的需要。2穿孔膜片钳电生理结果表明NA对SGN细胞GABA电流的抑制作用是由α2肾上腺素受体介导的,α2肾上腺素受体激活后可通过抑制腺苷酸环化酶减少胞内cAMP含量,降低PKA活性,进而导致GABA对SGN的抑制作用减弱。表明源于交感系统的NA可通过抑制GABA反应来调控SGN的听觉信息传递。