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1黄蜀葵花总黄酮减轻过量白蛋白诱导的肾小管上皮细胞损伤的机理研究背景:慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是目前威胁人类健康的常见慢性疾病,蛋白尿是其临床表现之一,也是促进其进展的独立危险因素之一。目前临床常用的减轻蛋白尿的药物效果不佳,且副作用相对明显,因此寻找一种有效的药物防御蛋白尿造成的肾脏损伤至关重要。在体外实验中可以应用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)模拟体内蛋白尿的环境,建立体外肾小管上皮细胞蛋白尿损伤模型。中药黄蜀葵花(Abelmoschus manihot(L.)Medic.,AM)是一种临床应用广泛的中药材,其中黄酮类化合物是其主要成分,有抗炎抗氧化等作用。临床上常用AM治疗CKD以及蛋白尿,但是其作用机理尚不明确。目的:探讨黄蜀葵花总黄酮(Total flavones of A.manihot,TFA)对肾小管细胞在蛋白尿损伤中的保护作用及其作用机制。方法:采用正常大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)体外培养,在倒置的光学显微镜下观察细胞的形态变化,CCK-8检测细胞活性,流式细胞学检测细胞凋亡比例,通过FITC标记BSA,检测细胞对BSA的摄取情况,FITC/PI染色在倒置荧光显微镜下观察细胞凋亡染色情况,Western Blot探讨作用机制。结果:低内毒素BSA40mg/ml可引起细胞活性下降,(P<0.01)。流式细胞学检测证实凋亡增加,FITC/PI染色证实凋亡染色增加,Western Blot检测发现凋亡相关蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)以及 PARP活化增加。而应用TFA干预细胞后,可明显的改善细胞活性(P<0.01),减轻流式细胞学以及FITC/PI凋亡染色阳性率,并减少凋亡相关蛋白Caspase-3以及PARP的活化。BSA可以增加ERK的磷酸化,并激活Nlrp3炎症小体,增加天冬氨酸蛋白水解酶-1(Cysteiny1 aspartate specific proteinase-1,Caspase-1),白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL-1β)的活化。应用ERK,Nlrp3抑制剂可减轻BSA诱导的细胞活性下降(P<0.01),减少细胞凋亡。而TFA则可以抑制BSA诱导的ERK以及Nlrp3炎症小体的活化,在应用ERK抑制剂时,Nlrp3炎症小体的活化也被抑制。结论:TFA可以减轻BSA诱导的NRK-52E细胞凋亡,其作用机理可能与抑制ERK1/2调控Nlrp3炎症小体相关。2甘草次酸调控间隙连接保护肾小管上皮细胞的机理研究背景:目前CKD的发病率逐年升高,既往众多研究指出,早期CKD患者体内氧化应激水平较正常人即明显升高,可能促进CKD的进展。因此有效减轻CKD患者氧化应激状态对延缓CKD的进展至关重要。而Px-12是一种硫氧还蛋白1(Thioredoxin1,Trx1)的药理学抑制剂,通过抑制Trx1的还原性引起细胞内氧化还原信号转导异常,造成氧化损伤。甘草是临床常用的中药之一,其主要有效成分18α-甘草次酸(18α-Glycyrrhetinic acid,18α-GA)有清热解毒、抗氧化的作用。但是其对减轻CKD病程中持续存在的氧化应激状态作用机制尚未明确。目的:探讨18α-GA对Px-12诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用以及机理。方法:在体外培养的条件下应用NRK-52E细胞进行实验。细胞按照正常组,Px-12组,正常组+18α-GA 组,Px-12+18α-GA 组,正常组+SP600125 组,Px-12+SP600125 组。用 Px-12干预细胞后建立细胞损伤模型,通过CCK-8检测细胞活性,TUNEL/DAPI双染检测细胞凋亡,ROS/02-探针试剂盒检测细胞内ROS以及O2-的表达水平,并通过Western Blot探讨其机制,应用Cx43 siRNA经脂质体转染细胞下调Cx43蛋白的表达探讨Cx43的作用。结果:CCK-8结果显示Px-12组细胞活性较正常组下降(P<0.01),而Px-12+18α-GA组,Px-12+SP600125 组细胞活性较Px-12 组高(P<0.01)。TUNEL 染色发现 Px-12 组 TUNEL阳性细胞高于正常组,而Px-12+18α-GA组,Px-12+SP600125组TUNEL阳性细胞较Px-12组减少,Western Blot 结果显示 Px-12 组 Cleaved Caspase-3,p-JNK,Cx43 高于正常组,而Px-12+18α-GA 组,Px-12+SP600125 组则较 Px-12 组低,ROS/O2-探针检测证实 Px-12 组细胞ROS以及O2-高于正常组,而Px-12+18α-GA组,Px-12+SP600125组则较Px-12组低。转染Cx43 siRNA下调Cx43后,Px-12干预细胞后,细胞活性较对照组高(P<0.01),p-JNK,Cleaved Caspase-3表达较对照组减少。结论:18α-GA可减轻Px-12诱导的NRK-52E细胞凋亡,其机制可能与抑制间隙连接并调控JNK信号通路相关。3丹参酮Ⅱa磺酸钠通过调控ASK1/p-38信号通路减轻PDS诱导的腹膜细胞损伤背景:终末期肾脏病(End stage renal disease,ESRD)患者替代治疗的方式主要有腹膜透析以及血液透析。腹膜透析过程中,长期应用高糖腹膜透析液(Peritoneal dialysis solution,PDS)会引起腹膜间皮细胞(PMCs)损伤,腹膜功能失调甚至腹膜透析功能衰竭。而目前尚无有效的延缓腹膜功能衰竭的方法。因此寻找一种有效的药物减轻高糖PDS对PMCs的损伤,维持腹膜正常生理功能尤为重要。丹参是一种常见的中药,有活血祛瘀,通经止痛,清心除烦,凉血消痈的功效,已经广泛应用于临床,其有效成分丹参酮Ⅱa(TanⅡa)多应用于心脑血管疾病,可有效的扩张血管改善预后。也有研究显示丹参酮Ⅱa有调节氧化应激的作用。目的:证实Tan Ⅱa在高糖PDS诱导的PMCs细胞损伤中的作用以及作用机理。方法:采用人腹膜间皮细胞株体外培养,并按照正常组(C),模型组(M),正常+Tan组(C+T),模型组+Tan组(M+T),正常+NAC组(C+N),模型+NAC组(M+N)。应用倒置的光学显微镜观察细胞的形态变化,CCK-8检测细胞活性,ROS/O2-探针检测试剂盒检测细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)以及超氧阴离子的生成,OxyBlot蛋白氧化检测试剂盒评价氧化修饰蛋白的表达量,TUNEL/DAPI双染评估细胞凋亡,Westem Blot探讨作用机制,ASK1 siRNA转染细胞后探讨ASK1的作用。结果:M组CCK-8检测后发现细胞活性较C组下降(P<0.05),而M+T,M+N组细胞活性较M组改善(P<0.05),同时经TUNEL、Western Blot检测凋亡证实M组凋亡细胞较C组增多,而M+T,M+N组凋亡细胞则较M组减少。ROS/02-以及氧化修饰蛋白检测发现M组ROS、02-、氧化修饰蛋白表达较C组增加,M+T,M+N组则较M组减少。Westem Blot进行机制探讨发现M组ASK1-p38活性较C组明显增加,而M+T,M+N组则较M组低。经转染ASK1siRNA下调ASK1后,发现ASK1下调后细胞活性改善(P<0.05),凋亡减少,同时ASK1-p38信号通路的活化也受到抑制。结论:PDS通过氧化应激诱导HMrSV5细胞凋亡,Tan Ⅱa可通过调节ASK1-p38信号通路减轻PDS诱导的细胞凋亡。