输注过表达TGF-β1和Il-10的供体树突状细胞对小鼠胰岛移植的影响

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lwb
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目的:  胰岛移植方法已逐渐成熟,可以替代采用外源性的胰岛素输注治疗Ⅰ型糖尿病,然则移植后排斥反应不可避免,诱导抗原特异性的移植耐受变成解决排斥反应难题的关键。构建携带人IL-10、TGF-β1有效基因片段的慢病毒载体,对两者单独及联合感染树突状细胞后诱导胰岛移植免疫耐受的情况进行比较,探讨移植免疫耐受机制及寻找延长小鼠胰岛移植物存活时间的最佳途径。  方法:  1.构建携带人TGF-β1和IL-10基因片段的慢病毒,两种病毒单独及联合感染DC2.4细胞,并筛选感染后稳定表达株。  2.依次将细胞分成A、B、C、D四个组:DC2.4作为对照(A),IL-10过表达的慢病毒感染后DC2.4(B),TGF-β1过表达的慢病毒感染后DC2.4(C),及两者联合感染后DC2.4(D)。运用流式细胞仪检测每组DC细胞CD80、CD86、MHCII的表达差异。分别提取四组DC细胞的RNA及蛋白,RT-PCR检测IL-12、IL-4、IL-6、IFN-Y等因子的表达;Westernblot检测TGF-β1、IL-10、IDO的表达量。  3.将四组DC细胞分别通过尾静脉注射到16只受体小鼠(BALB/c)体内,32只C57BL/6(H-2b)作为供体,进行肾被膜下胰岛移植。移植后21天取受体小鼠脾脏T淋巴细胞,流式细胞仪检测其CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞所占比例;移植后100天取受体小鼠肾脏,免疫组化法观察移植物存活时间。  4.运用SPSS17.0统计软件对实验数据进行分析,感染组两两间的比较采用LSD检验。  结果:  1.构建过表达TGF-β1和IL-10的慢病毒载体成功感染了DC2.4细胞。  2.慢病毒单独及联合感染DC后,细胞表面分子CD80、CD86、MHCII的表达量下调。感染后的三组细胞,IL-4 mRNA表达上调的同时下调IL-12、IL-6、IFN-mRNA表达。Western Blot结果显示,慢病毒感染的DC细胞组TGF-β1、IL-10、IDO的蛋白表达均上调,联合感染组与单独感染组间没有显著差异。流式细胞仪检测的结果表明,接受供体过表达TGF-β1和IL-10基因的树突状细胞后,受体小鼠脾脏T淋巴细胞的CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例升高,三个感染组间无明显差异,这与前面的RT-PCR及WB结果相一致。  3.免疫组化切片染色显示,胰岛移植后100天,接受供体过表达TGF-β1和IL-10的DC后,受体小鼠肾被膜下可见胰岛移植物仍然存活。  结论:  1.可通过构建慢病毒载体感染DC2.4获得过表达TGF-β1和IL-10的耐受性树突状细胞。  2.接受过表达TGF-β1和IL-10的供体DC可使受体脾脏的调节性T细胞(Treg)数量增加,诱导移植免疫耐受从而延长胰岛移植物的存活时间。
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