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糖尿病视网膜病变是一种常见的糖尿病微血管并发症,其病理机制复杂。肝脏作为调节机体糖类、脂类、蛋白质类等物质代谢的重要脏器,是胰岛素作用的主要器官,也是发生胰岛素抵抗的重要场所,对于糖尿病及其并发症的发生、发展至关重要。高血糖造成肝脏氧化应激系统异常,诱发肝细胞损伤,促使慢性炎症、胰岛素抵抗、脂肪酸氧化应激等发生。而慢性低度炎症在DR的发病机制中起着重要作用。我课题组前期体内研究发现从肝论治方药糖网2号对糖尿病视网膜病变大鼠的肝脏和视网膜均有一定的保护作用。本研究将从分子生物学角度,探究糖网2号治疗糖尿病视网膜病变的作用机制,为后期的临床研究提供依据。目的:1.运用网络药理学的方法,分析并筛选糖网2号治疗糖尿病视网膜病变的活性成分和可能的作用靶点和作用机制,为后续细胞实验提供可靠的方法学依据。2.建立高糖下人视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelial cells,RPE）细胞模型,观察糖网2号对高糖下ARPE-19细胞活性和凋亡的影响,并通过HMGB 1/TLR4/NF-κB信号通路,探究糖网2号改善糖尿病视网膜病变的调控机制,为后期临床应用提供分子生物学基础。3.以健康者为对照,探索糖尿病视网膜病变患者血清中miR-142-3P与HMGB1及炎症因子表达量的相关性,从基因角度探索糖尿病患者发生DR的潜在生物学标志。方法:1.网络药理学研究:通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）构建糖网2号的分子数据库,筛选药物的活性成分。通过OMIM、GeneCards、TTD数据库建立疾病靶点数据集,并运用UniProt数据库统一基因名称。将两个数据集进行映射处理,筛选重复靶点。运用STRING在线软件构件中药成分-疾病靶点PPI网络。通过Cytoscape软件网络分析,筛选核心靶点。最后,运用Metascape进行KEGG和GO富集分析。2.实验研究方法:（1）采用不同浓度梯度的葡萄糖DMEM/F12完全培养液处理ARPE-19,培养24h、48h,通过CCK8法检测细胞活性,筛选出造模的葡萄糖浓度和培养时间。（2）制备SD大鼠糖网2号含药血清,按照不同浓度梯度含药血清的培养基培养高糖下ARPE-19细胞24h,通过CCK8法检测糖网2号含药血清对高糖下ARPE-19细胞活性的影响。（3）建立高糖下ARPE-19细胞模型,按照正常组、模型组、甘露醇对照组、空白对照组、糖网2号低、中、高剂量组配制条件培养液,干预正常糖及高糖浓度的ARPE-19细胞。采用Hoechst-PI染色法检测糖网2号对高糖下ARPE-19 细胞凋亡的影响。（4）建立高糖下ARPE-19细胞模型,按照正常组、模型组、甘露醇对照组、空白对照组、糖网2号低、中、高剂量组配制条件培养液,干预正常糖及高糖浓度的ARPE-19细胞。采用qPCR检测各组HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-1β 表达情况,Western blot 法检测细胞中 HMGB1、TLR4、NF-κB、p-NF-K B蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达量结果,免疫荧光染色及半定量分析各组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达的变化以及蛋白定位情况,最后qPCR法检测含药血清miR-142-3P的表达水平。3.临床研究方法:采用横断面研究的方法,按照纳入排除条件,收集健康体检者30例、DM 30例、NPDR 26例、PDR 25例,提取静脉血清,采用qPCR检测血清中miR-142-3P的表达水平,ELISA法检测血清中的的HMGB1、TNF-α、IL-6、IL-1β 含量。结果:1.网络药理学研究结果表明,糖网网2号治疗糖尿病视网膜病变的主要涉及炎症、免疫、凋亡等生物学过程以及AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号传导途径、MAPK信号传导途径、IL-17、TNF等炎症信号通路等。2.实验研究:（1）不同浓度葡萄糖（5、25、35、45、55和65mmol/L）的完全培养基培养ARPE-19细胞,当葡萄糖浓度小于25mmol/L时,细胞呈促进生长趋势,当葡萄糖浓度大于25mmol/L时,细胞呈抑制生长趋势,其中当葡萄糖剂量为55mmol/L和65mmol/L时,细胞活力呈明显抑制状态（P＜0.05）,24h与48h细胞存活率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）与低糖完全培养基培养的正常组细胞比较,各组体积分数为5%和10%含药血清对ARPE-19细胞的抑制率与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组体积分数为20%和30%含药血清对ARPE-19细胞的抑制率与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）Hoechst-PI染色结果示:PI染色后,模型组能够观察到细胞呈玫红色,染色质固缩、核碎裂等典型的凋亡特征,含药血清组则表现为二者之间。各含药血清组的凋亡率均显著低于模型组（P＜0.05）,且中剂量组抑制作用最明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）a.qPCR检测结果示:以18s为内参,以正常组为参照,模型组HMGB1、TLR4、NF-κB、IL-1β mRNA的相对表达量显著高于正常组（P＜0.05）,低、中、高剂量组相对表达量均低于模型组,中剂量组的相对表达量与模型组比较,差异显著（P＜0.05）。b.Western blot结果示:以GAPDH为内参,以正常组为参照,模型组HMGB1、TLR4、p-NF-κB、NF-κB蛋白表达量显著高于正常组（P＜0.05）;低、中、高剂量组相对表达量在模型组和正常组之间（P＜0.05）,说明糖网2号干预高糖下ARPE-19细胞是有效的。c.ELISA结果显示,各组细胞培养上清中炎症因子水平,在正常组中最低,模型组中最高,二者差异有统计学意义（P＜0.05）,甘露醇对照组与正常组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。中药干预组介于正常组与模型组之间,它们与模型组之间的差异有统计学意义（P＜0.05）。d.免疫荧光染色及半定量分析结果显示,在低糖对照组中,HMGB1定位于ARPE-19细胞核中。模型组ARPE-19细胞HMGB1蛋白表达上调,HMGB1从细胞核转到胞浆。含药血清组胞浆HMGB1表达量均在正常对照组和模型组之间,其中,中剂量组胞浆HMGB1表达量较模型组改善最明显。TLR4在低糖对照组中表达量少。模型组ARPE-19细胞染色边界处可见TLR4蛋白大量表达,含药血清组TLR4表达量较模型组有不同程度的减少,其中,中剂量组TLR4的表达量明显减弱。免疫荧光强度半定量分析结果显示低剂量组和中剂量组TLR平均荧光强度均明显减弱。NF-κB在低糖对照组的细胞质中低表达。模型组ARPE-19细胞NF-κB蛋白表达量增加,且细胞核内出现NF-κB,表明高糖促使ARPE-19细胞NF-κB蛋白从胞浆向细胞核转移,完成下游炎症因子的合成与分泌。含药血清组NF-κB表达较模型组有不同程度的减少。e.含药血清qPCR结果示:以空白对照组为参照,比较miR-142-3P在各组含药血清中的表达差异。结果显示,含药血清组miR-142-3P表达量高于空白对照组,其中,中、高剂量组表达量显著高于空白对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）。3.临床研究:PDR患者HMGB1、TNF-α、IL-1β高于NPDR患者,差异有统计学意义（P＜0.05）,血清miR-142-3P相对表达量PDR组低于NPDR组,差异有统计学意义（P＜0.05）,Pearson相关分析显示,DR患者血清miR-142-3P与HMGB1、TNF-αIL-1β 含量均呈负相关（P＜0.05）。结论:1.通过网络药理学分析发现糖网2号与糖尿病视网膜病变的相关靶点众多,富集分析发现糖网2号治疗糖尿病视网膜病变与免疫、炎症凋亡通路有关,为进一步研究糖网2号的相关分子机制提供方法学依据。2.高糖诱导的ARPE-19细胞可抑制细胞活性、引起细胞的凋亡,促进HMGB1,TLR4、NF-κB以及下游炎症因子的表达,破坏血-视网膜外屏障。3.糖网2号可能通过上调miR-142-3p的表达,抑制高糖环境下ARPE-19细胞HMGB1/TLR4/NF-κB通路蛋白的表达,改善炎症反应,减少血-视网膜外屏障的损伤,起到治疗DR的作用。4.血清miR-142-3p/HMGB1与糖尿病视网膜病变程度有关,miR-142-3p可能成为糖尿病患者发生DR的潜在生物学标志。