几丁质(chitin)又称甲壳质，广泛存在于昆虫、甲壳类动物外壳，真菌细胞壁以及一些藻类中，是由N-乙酰氨基葡萄糖聚合而成的多糖。几丁质经脱乙酰化处理后得到壳聚糖(chitosan)。近十几年来，几壳质、壳聚糖的研究已在国内外广泛展开，它们在抗肿瘤、防治病源微生物、调节机体免疫力等方面的功能越来越引起人们的重视。但由于其在中性水溶液中的溶解性较差，因此几壳质、壳聚糖的开发利用上受到很大限制。通过酶解或化学的方法将壳聚糖降解为壳寡糖(oligochitosan)可以拓宽几壳质、壳聚糖在体内的应用。壳寡糖是由3～10个N-乙酰氨基葡萄糖残基或氨基葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键连接而成的寡糖，它具有良好的水溶性、组织兼容性，在生物体内易降解，同时也具有抑菌、抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等多种生理功能，因此已成为众多领域的研究热点。整体动物试验研究表明，壳聚糖、壳寡糖具有免疫调节作用，可以促进动物体内免疫功能细胞分泌各种免疫活性因子，然后通过这些因子的介导，使整个免疫系统功能增强。但对于它们在免疫系统中某一特定环节的作用仍存在分歧，比如壳聚糖、壳寡糖单独作用于单核／巨噬细胞能否诱导其分泌一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子。Giuseppe Balsamo等人认为壳聚糖单独作用于小鼠腹腔巨噬细胞，可明显诱导NO的生成。Hyung-Min Kim和Hun-Taeg Chung等人则认为壳聚糖或者壳寡糖单独作用于小鼠单核／巨噬细胞RAW264.7，不能诱导其产生NO和TNF，但可明显诱导经γ-干扰素(γ-IFN)预刺激的巨噬细胞产生NO和TNF。旋江丈.学硬全学世居丈馨 我们用复合纤维素酶降解壳聚糖制备的壳寡糖平均分子量约为1000 Da，N一乙酞化度小于15%，HPLc结果显示其主要组分为壳六糖。本课题以小鼠单核/巨噬}炎魏细胞RAW264.7为研究对象，观察壳寡糖单独作用于巨噬细胞对其产生NO的影响，并初步探讨了核转录因子一kapPaB(NF一KB)在这过程中的作用，旨在部分解释壳寡糖对免疫系统调节作用的机理，为其在医学上的应用提供理论依据。试验中采用Western blot法检测细胞核内NF一沼的变化，用Griess还原法观察壳寡糖对巨噬细胞释放NO的作用以及NF一KB抑制剂对壳寡糖诱导巨噬细胞释放NO作用的影响。用诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒测定胞质内iNOS的活性。 试验结果表明:用80林留ml剂量的壳寡糖作用于RAW264.7细胞(4 Xl护个细胞/m 1) 12h便可以明显诱导NO的生成，随着刺激时间的延长，NO的产量不断增加，但增加的幅度逐渐变小。采用5、50、100、500林创ml剂量的壳寡糖分别作用于RAW264.7细胞(4 xro，个细胞/ml)18h，可以观察到在5一100林留ml剂量范围内，随着剂量的增加，NO的产量不断增加，iNOS的活性不断增强，至100林留ml时达到高峰。加入100林mol/L剂量的NF一忍抑制剂毗咯烷二硫代氨基甲酸盐 (PnTe)作用于RAWZ“.7细胞(4火10，个细胞/ml)90rnin，然后再加入100林留而剂量的壳寡糖对巨噬细胞进行刺激，发现PDTc在各个时间点(6、12、18、24h)都明显抑制壳寡糖对巨噬细胞No的诱导作用。westem blot结果显示1 00林岁ml剂量的壳寡糖作用于RAW264.7细胞(4 x 105个细胞/ml)4h，胞核内p65的含量明显增加，6h时达到高峰，10h时恢复到基础表达量，这就提示在壳寡糖对巨噬细胞的激活过程中NF一KB活化状态可以持续6个小时。 本试验表明:壳寡糖单独作用于单核/巨噬细胞可明显诱导iNOs基因表达，使NO生成增加，NF一妞信号传导途径参与壳寡糖对巨噬细胞的激活过程，这是壳寡糖在体外引起巨噬细胞免疫活性增强的重要细胞内信号传导机制。由于NF-KB抑制剂没有完全阻断壳寡糖对巨噬细胞产生NO的诱导作用，说明壳寡糖对巨噬细胞的活化过程还有其它信号通路的参与，因此进一步探讨Ca2+、丝裂原激活的蛋白激酶(MApK)及蛋白激酶C(PKC)等其它信号通路在壳寡糖诱导巨噬细胞产生NO中的作用，以及它们之间的协同机制对壳寡糖的开发利用具有重要的意义。