第一部分基于数字基因表达谱技术筛选胰岛β细胞内质网应激中差异表达基因目的:高血糖和高血脂等代谢紊乱可引起胰岛β细胞内质网应激,进而激活内质网应激下游通路,诱导细胞凋亡和或出现细胞功能紊乱。本研究旨在探索INS-1-3细胞在内质网模型中是否存在共同的差异表达基因及信号通路。方法:以正常培养基培养的INS-1-3做对照组,将毒胡萝卜素(thapsigargin,TG,0.1μmol/L,培养16个小时)、衣霉素(tunicamycin,TM,2.5μg/ml,培养16个小时),高糖(high glucose,HG,16.7mmol/L,培养12小时)+高脂(palmitic acid,PA,0.3mmol/L,培养12小时)建立内质网应激模型,并分别命名为TG组、TM组及HG+PA组。待造模成功,收取细胞提取RNA。利用数字基因表达谱技术分别筛选三组内质网应激模型与对照组相比差异表达的基因。对筛选出的基因进一步进行功能注释及Gene Oncology(GO)富集分析、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway富集分析及蛋白互作网络分析。最终通过定量PCR及WB验证数字基因表达谱的结果。结果:1.评估内质网应激模型。GRP78/Bip及CHOP是已知的内质网应激标志物。本研究用TM、TG及HG+PA培养细胞,并用RT-PCR检测GRP78及CHOP的m RNA水平。经TM、TG及HG+PA培养后GRP78 m RNA水平显著增加4.92倍、6.96倍和6.14倍(P<0.05),CHOP m RNA水平也显著升高5.92倍、5.27倍及6.51倍(P<0.05),结果表明TM、TG及高糖高脂培养可诱导INS-1-3细胞出现内质网应激。2.数字基因表达谱测序与质量评估。测序仪产生的原始图像数据经Base Calling转化为序列数据,称之为Raw Data。由于Raw Data可能包含低质量序列、Adaptor序列等,不能直接用于信息分析,必需经过数据处理之后,转换为Clean Data。经高通量测序后,对照组总共得到11968330,12351978,12559884个Raw Data,其中Clean Data占99.53%,99.53%,99.52%;TM组总共得到12476635,12572138,11846678个Raw Data,其中Clean Data占99.53%,99.53%,99.52%;TG组总共得到12227268,12048856,12421592个Raw Data,其中Clean Data占99.53%,99.53%,99.54%;HG+PA组总共得到12572491,12148256,12074804个Raw Data,其中Clean Data占99.53%,99.53%,99.53%。下一步,利用Clean Data进行差异基因表达分析、GO功能显著性富集分析及信号通路显著性富集分析。3.差异表达的基因分析。采取NOIseq方法筛选在组间有差异表达的基因。与对照组相比,TM组有135个差异表达基因,其中99个基因表达上调,36个基因表达下降;TG组有57个差异表达基因,45个基因表达上调,12个基因表达下降;HG+PA组有74个差异表达基因,其中49个基因表达上调,25个基因表达下降。4.GO功能显著性富集分析。为了了解差异表达基因的功能,我们对这些差异基因进行了功能富集分析,按照生物途径(Biology Process),分子功能(Molecular Function)和细胞定位(Cellular component)对基因进行注释和分类。在对TM组差异表达基因进行功能注释过程中,共有30个注释有统计学意义,其中细胞定位注释占40%(12条),分子功能注释占20%(6条),生物途径注释占40%(12条)。在对TG组差异表达基因进行功能注释过程中,共有28个注释有统计学意义,其中细胞定位注释占43%(12条),分子功能注释占18%(5条),生物途径注释占39%(11条)。在对HG+PA组差异表达基因进行功能注释过程中,共有9个注释有统计学意义,其中细胞定位注释占55.6%(5条),生物途径注释占44.4%(4条),无分子功能的显著注释。在3个内质网应激模型中,细胞定位的注释主要位于内质网区域;分子功能的注释提示这些差异表达基因多与细胞氧化应激过程相关;而生物途径的注释结果提示这些基因主要参与细胞抗原加工和呈递、蛋白质代谢、细胞稳态信号转导的途径。在对TG组差异表达基因进行功能注释过程中,共有28个注释有统计学意义,其中细胞定位注释占43%(12条),分子功能注释占18%(5条),生物途径注释占39%(11条)。在对HG+PA组差异表达基因进行功能注释过程中,共有9个注释有统计学意义,其中细胞定位注释占55.6%(5条),生物途径注释占44.4%(4条),无分子功能的显著注释。在3个内质网应激模型中,细胞定位的注释主要位于内质网区域;分子功能的注释提示这些差异表达基因多与细胞氧化应激过程相关;而生物途径的注释结果提示这些基因主要参与细胞抗原加工和呈递、蛋白质代谢、细胞稳态信号转导的途径5.Pathway显著富集分析。根据挑选出的差异基因,计算这些差异基因同Pathway的超几何分布关系,明确差异表达基因在内质网应激过程中参与的信号通路。在TM组中120个差异表达的基因与120个通路相关;TG组中57个差异表达基因与72个通路相关,其中仅有12个通路被显著富集;在HG+PA组中21个通路被显著富集。富集的信号通路包括内质网应激、抗原加工及呈递,蛋白运输等,其中仅有MODY通路在三组均被显著富集(表1)。MODY信号通路中,在三组均出现下调的基因为运动神经元和胰腺同源异型盒1(motor neuron and pancreas homeobox 1,Mnx1)及NK6同源框蛋白1(NK6 homeobox 1,NKX6.1)。在TM、TG及HG+PA组Mnx1分别下降至45%,59%,35%,Nkx6.1分别下降至55%,46%,54%。在TM及TG组,Bhlha15(basic helix-loop-helix family,member a15)表达上升至3.84,3.7倍。6.PCR及WB验证DGE结果。RT-PCR与WB检测TM及TG培养INS-1-3细胞中Nkx6.1、Mnx1及Bhlha15表达情况。经TM、TG培养后Nkx6.1及Mnx1 m RNA及蛋白水平显著下降(P<0.05),Bhlha15 m RNA及蛋白表达升高(P<0.05)。其趋势与数字基因表达谱相同。数字基因表达谱结果提示,TM组Nkx6.1及Mnx1 m RNA分别降至55%及45%,Bhlha15 m RNA上升至3.84倍;TG组Nkx6.1及Mnx1 m RNA分别降至46%及59%,Bhlha15 m RNA上升至3.7倍。RT-PCR结果提示,TM组Nkx6.1及Mnx1 m RNA分别降至81%及80%,Bhlha15 m RNA上升至5.77倍;TG组Nkx6.1及Mnx1 m RNA分别降至68%及51%,Bhlha15 m RNA上升至5.51倍。故表达倍数略有差异。第二部分Nkx6.1在糖脂毒性引起内质网应激过程中的作用目的:同源盒转录因子Nkx6.1在β细胞分化、发育及维持成熟β细胞功能中起到重要作用。利用数字基因表达谱发现糖脂毒性可引起INS-1-3细胞内Nkx6.1表达下降。本课题拟通过慢病毒转染建立Nkx6.1基因过表达的稳转INS-1-3细胞系,用该细胞系建立糖脂毒性模型,比较不同处理下细胞的增殖、凋亡、胰岛素分泌功能和相关基因表达,从而了解该转录因子在糖毒性中是否起关键作用。方法:以正常培养基培养的INS-1-3做对照组,使用毒胡萝卜素(0.1μmol/L,培养16个小时)、衣霉素(2.5μg/ml,培养16个小时),高糖(16.7mmol/L,培养12小时)+高脂(0.3mmol/L,培养12小时)建立内质网应激模型,并分别命名为TG组、TM组及HG+PA组。待造模成功,收取细胞提取RNA。利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测Nkx6.1及两个内质网应激标志物GRP78/Bip、CHOP的表达水平。应用MTT检测细胞增殖情况。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;应用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测β细胞分泌功能,并使用ELISA方法检测胰岛素浓度。结果:1.Nkx6.1过表达验证。在TM、TG、高糖高脂所致的三个内质网应激模型中,Nkx6.1表达均显著下降,提示这个与β细胞分化及功能相关的转录因子可能在内质网应激过程中发挥作用。本研究依托公司获得Nkx6.1过表达稳转细胞,同时转染GFP作为空载对照。本实验对转染细胞进行了正常培养及高糖高脂培养,并检测细胞Nkx6.1m RNA及蛋白表达水平变化情况。INS-1-3细胞Nkx6.1m RNA表达水平显著升高了8.1倍(P<0.05),Nkx6.1蛋白水平升高至1.35倍(P<0.05),提示稳转过表达Nkx6.1的INS-1-3细胞系成功建立。予INS-1-3细胞、转染GFP或Nkx6.1细胞高糖高脂培养,并将正常培养细胞作对照,发现在三组细胞中,Nkx6.1m RNA水平分别下降32.0%、14.2%及38.0%,但差异并无统计学意义(P>0.05)。在INS-1-3和Nkx6.1过表达细胞中经高糖高脂培养,Nkx6.1蛋白表达水平分别下降19.6%和18.5%,且差异有统计学意义(P<0.05)。故高糖高脂培养可降低INS-1-3细胞内Nkx6.1m RNA及蛋白表达水平。2.Nkx6.1过表达对INS-1-3细胞高糖高脂培养诱导内质网应激水平变化。INS-1-3细胞经TM、TG及高糖高脂培养后,内质网应激标志物GRP78/Bip及CHOP/GADD153显著升高,细胞出现明显内质网应激。同样,本研究将GFP过表达及Nkx6.1过表达细胞在高糖高脂培养基中培养,探究Nkx6.1对糖脂毒性毒性引起的内质网应激的影响。INS-1-3细胞经TM、TG及高糖高脂培养后GRP78/Bip的m RNA水平分别上升至6.96,4.92及6.14倍;CHOP的m RNA水平上升至5.92,5.27及6.51倍;GFP过表达细胞经高糖高脂培养后,GRP78/Bip及CHOP的m RNA水平分别上升至5.48,7.73倍。在Nkx6.1细胞中,高糖高脂培养导致GRP78/Bip及CHOP m RNA水平上升至3.32倍及3.08倍,结果均有统计学意义(P<0.01)。说明高糖高脂培养可诱导INS-1-3细胞、GFP及Nkx6.1过表达细胞产生显著内质网应激。尽管经高糖高脂培养,Nkx6.1过表达细胞的GRP78/Bip及CHOP的m RNA水平也会显著上升,但两种内质网应激标志物m RNA水平显著低于INS-1-3及GFP过表达细胞(P<0.01)。3.Nkx6.1过表达对细胞增殖的影响。在正常培养条件下,INS-1-3细胞、GFP过表达及Nkx6.1过表达细胞活力无明显差异(P>0.05)。INS-1-3细胞经TM、TG及高糖高脂培养后,细胞活力显著下降37.5%,20%和45%(P<0.05)。GFP过表达细胞经高糖高脂培养后,细胞活力下降50%,且差异有统计学意义(P<0.05)。在Nkx6.1细胞中,高糖高脂培养导致细胞活力下降18.4%(P<0.05)。尽管高糖高脂培养导致三组细胞活力均明显下降,但Nkx6.1过表达细胞下降幅度低于另两种细胞。经高糖高脂培养后,Nkx6.1过表达细胞活力明显高于INS-1-3细胞及GFP过表达细胞(P<0.05)。故高糖高脂培养抑制INS-1-3细胞增殖,在细胞内过表达Nkx6.1可减轻这种抑制作用。4.Nkx6.1过表达对细胞凋亡的影响。在细胞凋亡早期,细胞膜暴露出磷脂酰丝氨酸,故FITC可结合磷脂酰丝氨酸(FITC+/PI-);在凋亡晚期,细胞膜不再完整,此时PI可透过细胞膜与DNA结合(FITC+/PI+)。为了进一步探究Nkx6.1在细胞凋亡中的作用,本研究利用流式细胞术检测细胞凋亡情况。在正常培养条件下,Nkx6.1过表达细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总体凋亡率均低于INS-1-3细胞,但其中仅有总体凋亡率有统计学意义(P<0.05)。在未转染细胞组,经TM、TG及高糖高脂培养后,细胞早期凋亡率分别升高至2.37,1.86,2.75倍;晚期凋亡率升高至2.23,1.96,1.54倍(P<0.01)。在Nkx6.1过表达组,经TM、TG及高糖高脂培养后,细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均有上升趋势(分别升高至1.60及1.57倍),但其中仅有晚期凋亡率变化有统计学意义(P<0.05)。暴露于高糖高脂环境过表达Nkx6.1的细胞,其早期凋亡率、晚期凋亡率及总体凋亡率均显著降低,分别为未转染细胞的30.2%,74.0%及54.6%(P<0.01)。故高糖高脂培养可导致INS-1-3细胞凋亡增加,Nkx6.1过表达可缓解高糖高脂对细胞的毒性作用。5.Nkx6.1过表达对INS-1-3细胞胰岛素分泌功能影响。GFP过表达细胞在基础状态下分泌胰岛素量为6.33±0.82 ng/m L/h,高糖(20m M)刺激后胰岛素分泌量升高了3.1倍。Nkx6.1过表达细胞在基础状态下分泌胰岛素量为10.43±9.68 ng/m L/h。无论在基础状态还是高糖刺激下,对照组与Nkx6.1细胞分泌胰岛素量并无显著差异(P>0.05)。当GFP过表达细胞经过高糖高脂培养,其胰岛素分泌量分别减少了32.3%及56.0%(P<0.05)。说明高糖高脂会导致INS-1-3细胞基础及高糖刺激状态下胰岛素分泌减少,引起细胞功能障碍。经高糖高脂培养后,尽管Nkx6.1过表达细胞胰岛素分泌量减少5.8%。但差异不再显著(P>0.05),提示Nkx6.1在内质网应激过程中对INS-1-3细胞的保护作用。第三部分利拉鲁肽通过转录因子Nkx6.1减轻INS-1-3细胞内质网应激目的:GLP-1是一种可以保护β细胞抵抗内质网应激的多肽。上一研究中发现TM、TG等化学物质可引起β细胞内质网应激,并改变MODY信号通路基因表达。Nkx6.1过表达可以部分缓解高糖、高脂对INS-1-3细胞的毒性作用。本研究旨在探索该转录因子在GLP-1类似物减轻内质网应激过程中的影响及该转录因子影响内质网应激的可能机制方法:将INS-1-3细胞接种在6孔板上,并分为五组:正常培养细胞为对照组;毒胡萝卜素(0.5μmol/L,培养16个小时)建立内质网应激模型;毒胡萝卜素(0.5μmol/L,培养16个小时)与利拉鲁肽组;加入对照小干扰RNA;加入小干扰RNA降低Nkx6.1表达。利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测Nkx6.1及两个内质网应激标志物GRP78/Bip、calnexin的表达水平。同时检测错误折叠蛋白反应PERK、IRE1α及ATF-6通路及下游蛋白表达水平。应用MTT检测细胞增殖情况。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率;应用葡萄糖刺激胰岛素分泌实验检测β细胞分泌功能,并使用ELISA方法检测胰岛素浓度。结果:1.RT-PCR及WB检测Nkx6.1表达水平。INS-1-3细胞经TG培养后,Nkx6.1 m RNA水平显著下降43.6%(P<0.05)。为了进一步评估Nkx6.1对GLP-1保护作用的影响,本实验在内质网应激的细胞模型中加入利拉鲁肽,并利用小干扰RNA调整Nkx6.1表达水平。当在TG培养的INS-1-3细胞培养基加入利拉鲁肽后,其Nkx6.1 m RNA上升3.81倍,提示利拉鲁肽治疗可升高细胞内Nkx6.1表达水平。在细胞中加入小干扰RNA,与对照组相比,其Nkx6.1 m RNA水平下降40.6%。WB变化趋势也与PCR类似,当向细胞中加入TG,细胞内Nkx6.1蛋白水平下降51.2%(P<0.05),加入利拉鲁肽后,Nkx6.1蛋白水平升高1.51倍;后利用小干扰RNA,细胞内Nkx6.1蛋白水平下降55.4%。故TG培养可显著降低Nkx6.1表达水平,而利拉鲁肽治疗可升高细胞Nkx6.1蛋白水平,小干扰RNA可使Nkx6.1表达水平下降40%左右。2.利拉鲁肽对高糖高脂培养下INS-1-3细胞凋亡及增殖作用。为了进一步研究Nkx6.1在利拉鲁肽保护INS-1-3细胞中的作用,本实验利用MTT及流式细胞术检测细胞增殖及凋亡。经TG培养细胞增殖率显著下降(下降47.6%,P<0.01),利拉鲁肽培养可部分缓解细胞凋亡增加,细胞增殖率上升0.53倍。但降低细胞内Nkx6.1表达水平时,细胞增殖率再次下降,降低24.7%(P<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡提示,经TG培养细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及总体凋亡率分别升高2.19、1.59、1.78倍(P<0.05)。加入利拉鲁肽培养后可明显降低细胞凋亡率(P<0.01)。但当在降低细胞内Nkx6.1表达水平后,细胞凋亡率再次升高,与转染对照组相比,其早期凋亡率、晚期凋亡率及总体凋亡率分别升高0.55、0.10、0.20倍,其中仅早期凋亡及总体凋亡改变有统计学意义。故TG培养可减少细胞增值、诱导细胞凋亡,利拉鲁肽可缓解TG引起的毒性作用,但降低细胞内Nkx6.1表达水平减弱利拉鲁肽的保护作用。3.利拉鲁肽对高糖高脂培养下INS-1-3细胞胰岛素分泌功能作用。本研究通过葡萄糖刺激胰岛素分泌实验,评估INS-1-3细胞功能状态。经TG培养INS-1-3细胞基础状态胰岛素分泌减少57.0%,高糖刺激后胰岛素分泌减少54.6%(P<0.05)。向培养基中加入利拉鲁肽,细胞基础胰岛素分泌量及高糖刺激后胰岛素分泌量分别增加1.39、0.89倍。降低细胞内Nkx6.1水平,细胞基础胰岛素分泌量及高糖刺激后胰岛素分泌量分别减少了57.5%及54.0%(P<0.05)。故TG可引起INS-1-3细胞功能障碍,细胞出现基础及高糖刺激后胰岛素分泌减少,利拉鲁肽可部分缓解TG的损伤作用,但敲低Nkx6.1后利拉鲁肽保护作用减弱。4.利拉鲁肽可降低TG培养下INS-1-3细胞内质网应激标志物表达水平。TG是引起内质网应激主要物质,为了研究利拉鲁肽及转录因子Nkx6.1在内质网应激反应过程中作用,本研究选择GRP78/Bip及calnexin作为内质网应激标志物,通过PCR及WB了解标志物表达水平。经TG培养,INS-1-3细胞中GRP78/Bip及calnexin m RNA及蛋白水平明显升高(GRP78/Bip m RNA及蛋白水平分别升高4.49倍及1.69倍;calnexin m RNA及蛋白水平分别升高3.83倍及1.50倍,P<0.05)。当向培养基中加入利拉鲁肽后,GRP78/Bip m RNA及蛋白水平分别下降74.1%,29.7%;calnexin m RNA及蛋白水平分别下降22.0%,31.9%(P<0.05)。但降低细胞内Nkx6.1表达水平后,两个内质网应激标志物表达水平再次升高。因此,TG可导致INS-1-3细胞出现严重的内质网应激,利拉鲁肽可缓解内质网应激,但降低Nkx6.1表达水平减弱利拉鲁肽的作用,使细胞内质网应激程度再次升高。5.利拉鲁肽通过转录因子Nkx6.1影响未折叠蛋白反应三条通路。为了进一步探究利拉鲁肽及Nkx6.1对内质网应激的影响机制,本研究进一步分析了内质网应激过程中错误折叠蛋白反应的三条信号通路。TG使INS-1-3细胞内p-PERK蛋白水平明显升高;p-e IF2α是PERK通路下游分子蛋白,其蛋白水平同样明显升高(P<0.05)。提示经TG培养,UPR中PERK通路被激活。当向培养基中就加入利拉鲁肽后,p-PERK及p-e IF2α蛋白水平分别减少37.4%及39.1%(P<0.05)。但si Nkx6.1组,p-PERK及p-e IF2α蛋白水平有升高趋势,仅p-e IF2α变化有统计学差异(P<0.05)。IRE1α是IRE1的同源物,在各组织细胞中广泛表达,因此本研究应用IRE1α评估IRE1信号通路。结果提示TG可使INS-1-3细胞内IRE1α及p-JNK蛋白水平升高2.63倍、5.38倍,而利拉鲁肽可分别减少两种蛋白表达水平34.3%及60.0%(P<0.01)。有趣的是,尽管在培养加入利拉鲁肽,当降低细胞内Nkx6.1表达水平,IRE1α及p-JNK蛋白水平明显升高(1.82及1.48倍,P<0.05)。在ATF-6通路中,正常培养细胞ATF-6蛋白表达水平很低,但TG组该蛋白水平明显上升。利拉鲁肽可使ATF-6蛋白表达水平减少44.2%,但在细胞中转染si Nkx6.1可逆转利拉鲁肽的保护作用。在INS-1-3细胞中,TG使CHOP蛋白表达水平升高3.52倍(P<0.01)。当在培养基中加入利拉鲁肽可使CHOP蛋白水平降低66.8%。但降低细胞内Nkx6.1表达水平时,CHOP蛋白水平升高1.79倍。结论:1.毒胡萝卜素、衣霉素及高糖高脂可造成INS-1-3细胞凋亡增加及细胞功能障碍。2.利用数字基因表达谱筛选内质网应激模型组,发现在不同内质网应激模型中,公共差异表达基因集中在MODY信号通路中。该通路中共同的基因改变为Nkx6.1及Mnx1。3.Nkx6.1过表达能够部分缓解高糖/脂模型导致的细胞凋亡增加,增殖抑制和葡萄糖刺激的胰岛素分泌下降。4.利拉鲁肽可部分通过转录因子Nkx6.1发挥对TG诱导的细胞内质网应激的保护作用。5.转录因子Nkx6.1可通过调控内质网应激过程中PERK、IRE1及ATF-6通路缓解内质网应激。