胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,在全世界范围内,胃癌在恶性肿瘤导致的死亡中位居第二位。胃癌发病率各国不一。我国每年约有17万人死于胃癌,几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4。由于早期缺乏特异的临床症状,临床诊治的病例绝大多数为中晚期,预后较差。Klotho基因是近期发现的一个新的抗癌基因。早期的研究认为Klotho基因与衰老密切相关。早期动物实验发现Klotho基因缺陷型小鼠会出现一系列类似人类衰老的表型,而过表达则能够延长小鼠的寿命,并发现Klotho基因通过抑制胰岛素信号通路抗衰老。近年来研究显示：Klotho基因与多种肿瘤密切相关,作为抑癌基因而失活,从而导致肿瘤的发生发展。虽有文献报道Klotho可能作为抑癌基因在胃癌中丢失,但Klotho在胃癌中表达改变的实际意义及其生物学功能目前仍不明确。本文拟展开Klotho在胃癌细胞株中的实验研究,由于Klotho基因通过抑制胰岛素信号轴抑制衰老和延长寿命,我们提出Klotho在胃癌中是否作为一种肿瘤抑制因子而存在?是否是通过抑制胰岛素信号轴抑制胃癌的生长、增值、促进胃癌细胞凋亡和自噬。因此,我们设计实验研究如下：1.研究Klotho基因及蛋白在人胃癌细胞株MNK-45、AGS、 GC-7901及人胃粘膜细胞株GES-1中的表达特点,分析Klotho基因及蛋白低表达的原因,研究Klotho基因的表达是否受表观遗传学的调控,是否与Klotho基因启动子区甲基化密切相关。2.给予不同浓度的去甲基化酶5-AZa干预胃癌细胞株GC-7901,检测不同浓度的5-AZa恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达是否呈现计量依赖性,并选择最佳浓度作为进一步研究,检测Klotho基因恢复后对胃癌细胞凋亡、自噬及胰岛素相关信号通路轴的研究。3.构建Klotho的真核表达载体,并瞬时转染胃癌细胞株GC-7901,构建高表达Klotho基因的胃癌细胞株GC-7901,为进一步研究做准备。4.研究高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901的增殖、凋亡、细胞周期、自噬及胰岛素相关信号通路的作用。第一章Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株中的表达目的：研究Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株MNK-45、AGS、GC-7901和人胃粘膜细胞GES-1中的表达特点。分析Klotho基因缺失的原因。方法：抽提以上四种细胞总RNA,采用PCR技术检测Klotho基因在胃癌细胞株MNK-45、AGS、GC-7901和人胃粘膜细胞GES-1中的表达,免疫印记检测Klotho蛋白在各组细胞株中的表达水平,甲基化特异性PCR (Methylation-Specific PCR, MS-PCR)检测以上四种细胞株Klotho基因启动子区甲基化程度,并分析其表达特点。结果：人胃粘膜细胞GES-1中Klotho基因及蛋白的表达显著高于胃癌细胞系MNK-45、AGS和GC-7901,经统计学分析,具有显著的统计学意义(P<0.001),而GC-7901Klotho基因及蛋白表达最低。经甲基化PCR检测发现胃癌细胞株MNK-45和AGS Klotho基因启动子区部分甲基化,胃癌细胞株GC-7901Klotho基因启动子区完全甲基化,而人胃粘膜细胞GES-1Klotho基因启动子区未见甲基化表达。结论：1. Klotho基因及蛋白在胃癌细胞株MNK-45、AGS和GC-7901中的表达明显低于人胃粘膜细胞GES-1中的表达,在胃癌细胞株GC-7901中的表达最低。2. Klotho基因低表达与启动子区甲基化密切相关,GC-7901胃癌细胞株中Klotho基因启动子区完全甲基化。第二章5-Aza诱导胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达及生物学意义目的：给予不同浓度的5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza)干预胃癌细胞株GC-7901,检测不同浓度的5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达是否呈现计量依赖性,并选择最佳浓度作为进一步研究,研究5-Aza干预胃癌细胞株GC-7901后Klotho基因及蛋白的表达情况,并检测Klotho基因的恢复对胃癌细胞株GC-7901凋亡、生噬及胰岛素相关信号通路轴的影响。方法：选择不同浓度的5-Aza5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L干预胃癌细胞株GC-7901,72小时后用western blot检测Klotho蛋白及生噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达。选择5-Aza最佳浓度10μmol/L干预GC-7901,并应用生噬抑制剂3-MA提前干预,实验分三组：空白对照组、5-AZa组、3-MA+5-Aza组,流式细胞仪检测三组细胞的凋亡,western blot检测三组细胞中Klotho蛋白的表达和胰岛素信号通路轴相关蛋白IGF-1R及下游信号通路相关蛋白PI3K和mTOR的表达。Western blot检测P-IGF-1R及下游信号通路相关蛋白p-PI3K和p-mTOR的表达。免疫印记及共聚焦实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-I的表达。结果：1.不同浓度的5-Aza均可恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达,增加胃癌细胞的自噬,并呈计量依赖性,但10μmol/L5-Aza干预后胃癌细胞的状态最佳。2.10μmol/L5-Aza恢复GC-7901Klotho基因的表达后,可诱导胃癌细胞株GC-7901细胞自噬及凋亡增加。5-Aza组中细胞凋亡及自噬明显增加,与空白对照组相比具有统计学意义(P<0.05),3-MA可以抑制5-Aza组的生噬及凋亡,但不能完全抑制。3.10μmol/L5-Aza恢复GC-7901Klotho基因的表达,可抑制胰岛素相关信号通路轴中相关蛋白的磷酸化表达,p-IGF-1R、p-PI3K、 p-mTOR的表达明显减少,空白对照组与5-Aza组经统计学分析具有统计学意义(P<0.05)。但对总蛋白IGF-1R、PI3K、mTOR无影响。结论：1.不同浓度的5-Aza均可恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达,呈计量依赖性。2.5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达,可诱导胃癌细胞株GC-7901自噬及凋亡增加。3.5-Aza恢复胃癌细胞株GC-7901Klotho基因的表达可抑制胰岛素信号通路相关蛋白p-IGF-1R、p-PI3K、p-mTOR的磷酸化表达,但总蛋白的表达未受影响。4.3-MA可以降低5-Aza恢复的GC-7901细胞中Klotho基因的表达,并且使自噬的表达有所减少,细胞凋亡有所减少。第三章Klotho真核表达载体的构建并转染胃癌细胞目的：构建Klotho真核表达载体并转染到胃癌细胞株GC-7901中,检测转染后的表达效率。方法：本实验首先构建一个Klotho基因的真核表达载体,将Klotho基因片段插入真核表达载体中,形成pZsGreenl-C1-Klotho重组表达载体。用限制性内切酶EcoR I, Hind Ⅲ, BglⅡ, Hind Ⅲ,限制性酶谱分析及基因序列测序分析确定pZsGreen1-C1-Klotho重组表达载体。继而将Klotho真核表达载体转染到GC-7901细胞中,建立高表达Klotho的GC-7901细胞系,采用RT-PCR及Western-blot分析转染后的Klotho基因及蛋白的表达情况。结果：1.成功构建Klotho真核表达载体pZsGreen1-C1-Klotho,并测序结果正确。2.将pZsGreenl-C1-Klotho及对照空白质粒转染GC-7901细胞后,RT-PCR及免疫印记检测Klotho基因及蛋白在各组细胞中的表达,GC-7901及空载体GC-7901细胞中Klotho基因及蛋白低表达,而pZsGreen1-C1-Klotho组中Klotho基因及蛋白的表达显著升高,是前两组Klotho表达的4倍(P<0.001),说明转染成功并且有效。结论：成功构建了Klotho的真核表达载体,并成功转染到人胃癌细胞株GC-7901中,并获得高表达Klotho基因的胃癌细胞株GC-7901。第四章Klotho基因对胃癌细胞凋亡、自噬及相关信号通路的作用目的：研究高表达Klotho基因对胃癌细胞株GC-7901增殖、凋亡、周期、白噬及胰岛素信号通路轴的影响,并对Klotho可能的作用靶点进行分析。方法：1.实验分为四组：GC-7901细胞株空载体组(blank vector, blank-V), GC-7901细胞株+转染Klotho载体组(Klotho expression vector, Klotho-V),3-MA预处理GC-7901细胞株+转染Klotho载体组(Klotho vector plus3-MA, k-V+3-MA), GC-7901细胞株转染Klotho载体+凋亡抑制剂Z-VAD-FMK组(Z-VAD-PMK, k-V+ZVP)。2.CCK实验绘制各组细胞增殖曲线,综合评价高表达Klotho对胃癌细胞株GC-7901增殖能力的影响。3.Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的凋亡和细胞周期情况,评价Klotho对GC-7901细胞凋亡及周期的影响。4. Western blot检测IGF-1R, IRS-1、PI3K、AKT、mTOR和p-IGF-1R、p-IRS-1、 p-PI3K、P-AKT、p-mTOR的表达,研究Klotho对胰岛素信号通路轴的影响。5. Western blot及共聚焦实验检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ的表达,研究过表达Klotho对胃癌细胞株自噬的表达调控。结果：1. Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测：Klotho-V组细胞增殖明显低于blank-V组(p＜0.001), k-V+3-MA和k-V+ZVP组细胞增值低于blank-V组(p<0.001),但k-V+3-MA和k-V+ZVP组之间无统计学意义(p>0.05)。2. Klotho的表达：blank-V组,Klotho-V组,k-V+3-MA组。Klotho在Klotho-V组表达最高,k-V+3-MA组中Klotho基因表达低于Klotho-V组,而高于blank-V,与第二章中5-AZa处理后给予3-MA组结果相似,说明3-MA可能通过某种机制影响Klotho基因的表达,从而使Klotho的表达有所减少。3. Klotho-V组中胰岛素相关信号通路及其下游信号通的磷酸化的表达明显低于blank-V组(p<0.001),即p-IGF-1R、p-IRS-1、p-PI3K、 P-AKT、p-mTOR的表达明显减少,说明Klotho可以抑制胰岛素信号通路轴中IGF-1R. IRS-1磷酸化表达,磷酸化p-IGF-1R、p-IRS-1受到抑制后从而影响下游p-PI3K、P-AKT、p-mTOR的表达。而k-V+3-MA组中Klotho表达低于Klotho-V的表达,其调控的胰岛素信号通路轴蛋白磷酸化水平亦低于Klotho-V组,说明Klotho对胰岛素信号通路中的调控具有剂量依赖性。而三组细胞株中IRS-1、 IGF-1R、PI3K、AKT、mTOR的总蛋白表达无统计学意义(p>0.05)。4. Klotho-V组中细胞凋亡明显高于blank-V组(p<0.001),胃癌细胞G0/G1百分比明显增加,细胞周期受到抑制。说明过表达Klotho可以促进人胃癌细胞株GC-7901凋亡,抑制细胞增值。流式细胞技术检测k-V+3-MA凋亡低于Klotho-V组,说明抑制胃癌细胞株自噬表达的结果导致细胞凋亡降低,流式细胞技术检测k-V+ZVP组显示细胞凋亡低于Klotho-V组。说明过表达Klotho组可以促进GC-7901细胞自噬和凋亡增加,但是3-MA可以抑制Klotho-V组自噬的发生,同时降低了胃癌细胞的凋亡率,凋亡抑制剂可以抑制Klotho-V组中细胞凋亡的发生,同时降低胃癌细胞自噬的表达。5.共聚焦实验检测blank-V组、Klotho-V组、k-V+3-MA、k-V+ZVP组中自噬的表达,Klotho-V组自噬表达明显上调,但可以被3-MA抑制,凋亡抑制酶同样可以减少自噬的表达,免疫印记检测再次证明过表达Klotho可以增加细胞自噬的表达,自噬抑制剂可以减少过表达组自噬的表达,凋亡抑制剂抑制过表达组凋亡后同时减少了自噬的表达,说明胃癌细胞株GC-7901在Klotho过表达的状态下自噬和凋亡互相促进。结论：1.外源性高表达Klotho可有效抑制胃癌细胞株GC-7901增殖,促进细胞凋亡,抑制周期；增加胃癌细胞自噬的表达。2. Klotho可能通过抑制胰岛素信号通路轴影响胃癌细胞的生物学活性,即抑制IGF-1R磷酸化,从而抑制下游信号通路相关蛋白IRS-1、PI3K、AKT、mTOR磷酸化的表达。