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5-羟甲基糠醛(HMF)是一个重要的生物基平台化合物,可以由碳水化合物脱水制备得到。HMF经选择性氧化可以转化为5-羟甲基-2-糠酸(HMFCA)及2,5-呋喃二甲酸(FDCA),这两个呋喃羧酸是制备药物、高分子等的重要中间体。目前,化学催化仍是合成呋喃羧酸的主流方式,但该法通常存在反应条件苛刻、选择性欠佳及使用金属等环境不友好催化剂等问题。生物催化氧化能有效解决上述问题,符合绿色可持续的发展理念,在HMF高值化转化中展现出广阔的应用前景。当前,生物催化HMF氧化领域仍处于初步研究阶段,已报道的能催化HMF选择性氧化的生物催化剂仍有限,并且其催化效率及底物耐受水平仍较低。由于HMF对生物催化剂具有较强的毒性和抑制作用,因此生物催化HMF高效转化仍颇具挑战。最近,本课题组从土壤中分离到一株睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni SC1588,该菌能高选择性催化HMF氧化,合成HMFCA。为了进一步挖掘该菌的催化潜能,我们首先借助底物适应性策略以提高该菌对HMF的耐受能力,并提高其催化HMF氧化效率;随后,将该菌与漆酶-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(TEMPO)体系进行偶联以构建级联生物催化体系,用于催化HMF级联氧化合成FDCA。结果表明,底物适应性策略不仅能显著提高睾丸酮丛毛单胞菌SC1588菌的催化活性,而且还能增强其底物耐受能力。然而,底物适应性驯化后该菌催化HMF氧化的最适pH及温度未发生变化。在反应体系中添加少量组氨酸及提高细胞浓度均能有效地增强睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞催化HMFCA合成。在最适反应条件下,该菌能在24h内将200 mM HMF完全氧化为HMFCA。甚至当底物浓度高达250-300 mM时,在该菌的催化作用下目标产物收率仍可达71-81%。该菌还能以各种呋喃醛和苯甲醛为底物合成各种目标羧酸,产率最高达98%。对叔丁基邻苯二酚(TBC),作为某些商品化HMF中的稳定剂,首次被发现会对丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞催化活性产生较强的负面影响。漆酶-TEMPO体系在pH 6.0和30℃下均能保持较高的催化活性。缓冲液中磷酸盐浓度对于漆酶-TEMPO体系催化HMF氧化影响显著,提高盐浓度能有效促进FDCA的合成。漆酶-TEMPO体系不仅能催化HMF氧化,而且还能催化BHMF、HMFCA及FFCA氧化,并且在HMFCA氧化中表现出较高的催化活性,但催化FFCA氧化则较慢。TEMPO,尤其是其浓度大于20 mM时,对睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞活性和稳定性产生显著的负面影响。基于上述结果,我们构建了由漆酶-TEMPO与睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞组成的级联氧化体系,用于HMF氧化合成FDCA。睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞先将HMF快速氧化为HMFCA,后者被漆酶-TEMPO氧化为5-甲酰基-2-糠酸(FFCA),最后FFCA被睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞转化为FDCA。当底物浓度为100 mM时,反应36 h后,FDCA产率达92%。本研究利用简单的底物适应性策略显著的提高了睾丸酮丛毛单胞菌SC1588的催化性能,揭示了底物中作为稳定剂的对叔丁基邻苯二酚(TBC)对微生物细胞具有较强毒副作用;并基于睾丸酮丛毛单胞菌SC1588细胞与漆酶-TEMPO催化HMF及其衍生物氧化的底物特异性,构建了一个新型、高效生物催化HMF级联氧化途径以制备FDCA。该研究不仅丰富了生物基平台化合物转化的相关理论知识,而且还将为高附加值呋喃衍生物的大规模制备奠定技术基础。