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研究背景和研究目的:心肌缺血/再灌注损伤是指由冠状动脉血液供应不足继而复灌引起的心肌细胞不可逆损伤,目前尚无有效的治疗方法。积雪草酸是一种来源于热带药用植物积雪草的五环三萜类化合物,具有广泛的生物活性。在本研究中,我们通过体外建立大鼠H9c2心肌细胞氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型,来模拟体内心肌缺血再灌注损伤,观察积雪草酸对H9c2细胞OGD/R损伤的保护作用,并在此基础上探讨其心肌保护作用的分子机制,以期为治疗心肌缺血/再灌注损伤提供新的潜在药物。实验方法:1.心肌细胞OGD/R损伤模型的制备:使用不同浓度的积雪草酸(0.1,1,10,100μM)预处理体外培养的H9c2细胞4 h,然后缺氧1 h,复氧12 h制备心肌细胞损伤模型,通过MTT和LDH漏出率检测观察不同浓度积雪草酸对H9c2细胞损伤的保护作用。2.采用Hoechst33258荧光染料染色,观察积雪草酸(10μM)对OGD/R损伤模型心肌细胞凋亡的影响;检测各组心肌细胞Caspase-3和Caspase-9活性;Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达。3.使用2’,7’-二氯荧光素(dichlorofluorescein,DCF)检测胞内活性氧(ROS)含量;应用Fluo-3 AM荧光探针检测细胞内钙浓度;应用JC-1染料测定心肌细胞线粒体膜电位,以此评价积雪草酸对OGD/R损伤后心肌细胞线粒体功能的影响。4.采用Western blot方法分析OGD/R处理后Akt、磷酸化Akt、GSK-3β、磷酸化GSK-3β和HIF-1α等蛋白的表达变化以及积雪草酸的干预作用;并结合用Akt抑制剂MK2206和HIF-1α抑制剂2-ME,试图阐明积雪草酸的心肌细胞保护作用的可能分子机制。实验结果:1.0.1-10μM积雪草酸对正常条件下H9c2细胞活力没有影响,但可有效对抗OGD/R诱导的心肌细胞损伤,并呈浓度依赖性。2.10μM积雪草酸可明显减少OGD/R损伤诱导的H9c2细胞凋亡,降低细胞Caspase-3和Caspase-9活性,阻止缺氧条件下Bax上调和Bcl-2下调。3.10μM积雪草酸可显著减少OGD/R损伤诱导的活性氧过量产生,抑制线粒体膜电位降低,阻止钙离子的释放,有效改善缺氧条件下的线粒体功能。4.积雪草酸可显著上调OGD/R损伤后的磷酸化Akt和磷酸化GSK-3β水平,增加HIF-1α表达;使用Akt抑制剂MK2206和HIF-1α抑制剂2-ME可明显拮抗积雪草酸的心肌细胞保护作用。结论:积雪草酸预处理对H9c2心肌细胞OGD/R损伤模型有明显的保护作用,其机制主要与其激活Akt/GSK-3β/HIF-1α信号通路,进而显著减少缺血再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡及改善线粒体功能紊乱有关。