背景与目的：肺癌居我国乃至全球恶性肿瘤死因首位，可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类型，其中非小细胞肺癌约占80%以上。最新数据显示2008年全球约有160.88万的新发肺癌患者，137.84万患者死于肺癌。然而就目前的诊疗现状，肺癌总的5年生存率在发达国家约为16%，我国低于10%。在临床治疗中通常对EGFR突变型患者采用EGFR-TKI治疗，ALK融合变异型肺癌采用ALK-TKI治疗（crizotinib于今年被美国FDA批准上市），基于肺癌发生发展的驱动分子变异（driver mutation）的治疗能够明显获益。然而单一的靶向治疗终究会出现耐药，针对耐药机制和克服耐药的药物也正在研发中。对于晚期EGFR、ALK等均为野生型的肺癌患者，含铂化疗仍然是标准方案。在总体疗效不佳的现实基础上，寻找包括凋亡、细胞周期等通路上的新的靶点及其有效靶向药物对提高肺癌的总体疗效是具有重要临床转化意义。“逃逸死亡”（resisting cell death）是肿瘤细胞的恶性特征之一。凋亡信号通路中的凋亡信号分子总体上可分为调节分子（regulator）和效应分子（effector）两部分。肿瘤在发生和演进过程中，凋亡相关信号分子的表达改变贯穿始终。凋亡的过程基本分为活化过程（activation）或执行过程（execution）。如何活化肿瘤组织中的凋亡促进分子诱导凋亡（如促进Caspase3的剪切活化）是抗肿瘤治疗中的重要课题。本研究利用基于组织芯片的免疫组化分析观察凋亡信号分子BIRC5（Survivin）、CASP8、CASP9、C-PARP1、PARP1、BCL2、CASP3、C-CASP3、XIAP九个凋亡相关分子在肺癌患者的癌与癌旁组织中表达差异并分析凋亡分子表达水平与临床预后参数的关系。探索肺癌中潜在可干预的重要的凋亡通路分子靶点的变化。体外细胞实验分析肺癌细胞系中凋亡促进剂CASP3活化剂胱冬肽酶原激活物1（procaspase-activating compound1, PAC-1，可促进细胞内CASP3活化成C-CASP3）与顺铂（CIS）联用抗肿瘤效应，寻找靶向药物和化疗药的最佳作用模式及其靶向药物PAC-1抗肿瘤的作用机制。第一部分基于组织芯片的IHC技术检测PARP1/CASP3等凋亡相关分子在肺癌中的表达水平及分析其与临床生存因子的相关性方法收集广州医学院附属肿瘤医院2000年1月～2006年6月非小细胞肺癌切除组织石蜡标本144例。应用Beecher Instruments公司的组织芯片制备仪制备组织芯片。组织芯片中包括26例癌组织和癌旁组织的配对石蜡标本。癌旁组织标本取自离肿瘤组织边缘5-7cm处的肺组织。采用免疫组织化学方法检测分析CASP3、CASP8、CASP9、PARP1、Cleaved-CASP3（活化形式的CASP3，C-CASP3）、Cleaved PARP1（胱冬肽酶剪切PARP1形成活化形式的89Kd的大片段，即C-PARP1）、XIAP、BCL2、BIRC5（Survivin）等九个分子的蛋白表达水平。每个肿瘤样本分别根据染色强度（阴性＝0、弱阳性＝1、中等阳性＝2、强阳性＝3）和染色范围(0%=0、1–10%=1、11–50%=2、51–80%=3、81–100%=4)评分。然后将这两项得分相乘，得到一个IHC积分，范围由0分至12分。将IHC积分≥6的认为是该蛋白分子高表达，低于6分的计为该蛋白分子低表达。结果1.配对的癌与癌旁组织中凋亡相关分子的表达水平分析在可分析的25例配对的癌与癌旁组织比较分析发现，CASP3、C-CASP3、PARP1、CASP9、BCL2、XIAP、BIRC5（Survivin）等分子在癌组织均有显著性差异的升高表达（P<0.01）。C-PARP1、CASP8在癌与癌旁两组间未见显著差异（P>0.05）。2.非配对的癌（n=139）与癌旁组织（n=25）中凋亡相关分子表达水平非参数秩和检验结果提示CASP3、C-CASP3、PARP1、CASP9、BCL2、XIAP、BIRC5（Survivin）两组间比较发现在癌组织均有显著性差异的升高表达（P<0.01）。C-PARP1在癌与癌旁两组间未见显著差异（P>0.05）、CASP8分子在癌组织表达显著性低于在癌旁组织的表达（P<0.05）。3.凋亡相关分子表达与临床病理、生存因素之间的关系C-CASP3、CASP8在非鳞癌中表达高于鳞癌（P<0.05）；BCL2、PARP1等在鳞癌表达高于非鳞癌（P<0.05）；PARP1也与男性、吸烟等因素相关（P<0.05）；BIRC5(Survivin)在男性、吸烟者中表达高于女性、不吸烟患者(P<0.01）；BIRC5(Survivin)在鳞癌中表达高于非鳞癌(P<0.01）。Kaplan-Meir生存曲线分析和多变量Cox回归模型分析发现除了疾病分期或组织学类型与NSCLC的总生存（overall survival，OS）有关联，可见C-PARP1分子高表达与肺癌患者的较短的中位总生存期关联，初步提示C-PARP1可能是肺癌的独立的不良预后因子。结论蛋白表达水平证实在配对或非配对的癌与癌旁组织比较中，CASP3、PARP1、CARP9、XIAP、BCL2、BIRC5（Survivin）等凋亡调节或效应分子均在癌组织有统计学意义的表达升高。提示CASP3、PARP1、BCL2、BIRC5（Survivin）在肺癌中是特异的分子标志物，可能被作为抗肿瘤靶点。CASP3、CASP8在非鳞癌中表达高于鳞癌，BCL2、PARP1、BIRC5(Survivin)等在鳞癌表达高于非鳞癌。PARP1、BIRC5(Survivin)与男性、吸烟等因素相关。提示PARP1、BIRC5(Survivin)可能是吸烟者肺癌、鳞癌等亚群患者治疗的重要靶点之一。Kaplan-Meir生存曲线分析和多变量Cox回归模型分析发现提示C-PARP1表达水平可能是OS的独立预后因子。第二部分体外不同遗传背景的肺癌细胞系中顺铂联合PAC-1的抗肿瘤效应方法选择H1299（TP53部分缺失、EGFR与KRAS均为野生型）、A549（KRAS突变）、PC9（EGFR突变）、H1650（EGFR突变）、H1975（EGFR突变）等不同遗传变异背景的细胞系作为实验模型，采用抗增殖MTT（噻唑蓝）显色实验分析顺铂（CIS）、PAC-1（Caspase3活化剂即胱冬肽酶原激活物1，procaspase-activatingcompound1）单药或联合用药对肿瘤细胞的杀伤效应及协同效应。采用WesternBlot方法检测CASP3、CASP9、C-CASP3、PARP1、C-PARP1、XIAP及BCL2的表达变化（ACTB为内参照）。流式细胞术检测了各个实验组的细胞周期变化。采用免疫细胞荧光技术检测PAC-1处理前后细胞中的CASP3、C-CASP3；CIS处理前后C-PARP1的蛋白水平变化。结果1. MTT实验结果单药顺铂对H1299、A549、PC9、H1650、H1975在一定剂量条件下均有抗增殖效应，IC50值为1.9~11.2μmol/L。PAC-1对各株细胞在一定剂量条件下也具有抗增殖效应，IC50值为7.4~14.8μmol/L。当将两药联合使用时，只在H1299细胞中发现同时联合或CIS→PAC-1序贯用药具有协同杀伤作用。在其它4株细胞中未发现协同作用，多表现为拮抗作用（联合指数CI值>1.1）。2.流式细胞术检测药物干预的细胞周期结果：结果显示在所有5株不同遗传变异背景的细胞中，PAC-1阻滞细胞于G1期，而CIS阻滞细胞于G2期。在H1299细胞中CIS→PAC-1序贯联用组抗凋亡作用最强。3. Western Blot结果：结果显示在H1299细胞中PAC-1单药、顺铂联合或序贯PAC-1均能够明显诱导CASP3酶原活化成C-CASP3的作（即CASP3→C-CASP3转变），使得C-CASP3的水平升高。而在PC9和H1975细胞中，PAC-1具有较弱的诱导CASP3酶原活化成C-CASP3的作用。在H1299细胞中的基线C-PARP1水平较低，而在PC9、H1975细胞中基线C-PARP1相对较高。PAC-1在H1299和PC9细胞中具有一定的抑制基线或顺铂诱导的PAPR1→C-PARP1的转变。但C-PARP1的具体生物学功能需进一步研究。4.免疫荧光细胞化学结果：进一步采用免疫细胞化学染色观察了在各种细胞株中PAC-1促进CASP3酶原向活化形式的C-CASP3转变（即CASP3→C-CASP3转变）以及CIS有促进PARP1活化为C-PARP1的情况。结果发现在H1299细胞中PAC-1诱导CASP3酶原转化为C-CASP3的能力最明显，提示PAC-1在H1299细胞中可发挥明显的促凋亡作用。而在H1975、A549、H1650、PC9等细胞中PAC-1均促进CASP3酶原向C-CASP3转变的效应很弱或不明显。CIS在各细胞系中均能促进PARP1酶原活化转变为C-PARP1，在H1299、A549、H1975细胞中更为明显，同时发现C-PARP1在H1975中有一定的基础水平结论初步细胞实验结果显示在H1299细胞株中，CIS联合PAC-1用药具有协同作用。而在EGFR突变的PC9、H1650、H1975和KRAS突变的A549中，PAC-1联合顺铂在细胞生长抑制方面表现为相互拮抗作用。PAC-1可特异性地通过诱导CASP3活化成C-CASP3发挥促凋亡作用而协同铂类抗肿瘤细胞增殖。CIS有促进PARP1活化为C-PARP1的作用。