论文部分内容阅读
海藻糖酶(Trehalase,TRE)和海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是与昆虫降解和合成海藻糖直接相关的酶。海藻糖酶TRE可分为可溶型海藻糖酶TRE1和膜结合型海藻糖酶TRE2,可以将海藻糖分解为2分子的葡萄糖。TPS包含保守的海藻糖合成酶结构域和海藻糖-6-磷酸酯酶结构域,在两个结构域的协同作用下催化UDP-葡萄糖转化为海藻糖。 目前关于海藻糖酶和海藻糖合成酶的研究主要集中在几丁质合成方面,能量代谢方面的研究极少,本文选择海藻糖的合成代谢途径作为研究对象,以褐飞虱为实验生物,初步研究了TRE基因和TPS基因的功能,并探讨了TRE和TPS作为害虫控制靶标的分子机理。 首先克隆得到褐飞虱可溶型海藻糖酶TRE1-1、TRE1-2,膜结合海藻糖酶TRE2,海藻糖合成酶TPS1、TPS2基因并对其进行了生物信息学性质分析,得到结论如下:褐飞虱海藻糖酶TRE1-1,TRE1-2,TRE2和海藻糖合成酶TPS1、TPS2的cDNA长度分别为1692 bp、1475 bp、1995 bp、2421bp和2460 bp;它们翻译成的蛋白质氨基酸数目分别为564个、492个、665个、807个和820个;预测的蛋白等电点分别为5.51、4.99、6.18、6.14和6.07;预测蛋白的分子量分别为65.5 kD、57.9 kD、76.5 kD、90.5 kD和93.2 kD。 其次,选择5龄褐飞虱并对其进行了dsTRE和dsTPS的干扰实验和转录组测序实验,该实验以dsGFP注射组为参照,分别分析TRE1-1,TRE1-2,TRE2,TPS1,TPS2被干扰后基因整体差异表达情况,发现海藻糖酶TRE1-2被干扰后导致的差异表达基因最多,上调和下调基因分别有1143个和729个。海藻糖合成酶基因TPS1和TPS2被干扰后,表达上调基因分别有703个和506个;表达下调基因分别有658个和319个。 dsTRE和dsTPS注射48 h后可溶型海藻糖酶TRE1的活性都表现下降;dsTRE1-1和dsTRE1-2注射72 h后TRE1的活性高于dsGFP对照组;dsTRE和dsTPS注射48 h后膜结合海藻糖酶TRE2的活性下降而且dsTRE1-1,ds TRE1-2,dsTPS1和dsTPS2注射组的差异极显著;注射72 h后只有dsTRE1-2注射组显著性下降。与对照组相比dsTRE1-1,dsTRE1-2,dsTRE2,dsTPS1和dsTPS2注射48h后糖原的浓度都下降,dsTRE1-2,dsTRE2注射48h后海藻糖浓度下降。 向褐飞虱注射dsTRE和dsTPS后都表现出一定的畸形率和死亡率。对褐飞虱进行TRE和TPS干扰后出现3种主要畸形:蜕皮失败、翅型异常、蜕皮失败且翅型异常。TRE1-1,TRE1-2,TRE2所导致的的畸形率分别为22.04%,24.36%,19.83%,略高于TPS1和TPS2引起的畸形率。而注射TPS1,TPS2后,褐飞虱的死亡率分别为29.63%,28.62%,高于TRE注射组。