结直肠癌缺陷基因(deleted in colorectal carcinoma gene，DCC)是位于18q21.3上的抑癌基因。其表达产物为190KD的跨膜磷蛋白，参与细胞间或细胞和基质间的相互作用。 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是最重要的血管内皮因子，可诱导血管内皮细胞的增殖，在肿瘤的生长和转移中起着重要的作用，VEGF在许多肿瘤组织及培养的肿瘤细胞株中都有显著的高水平表达。 在人类肿瘤中，抑癌基因p53是突变最频发的基因，它位于17号染色体短臂上。P53蛋白是一种分子量为53KD的细胞核磷蛋白，它的产物调节细胞周期和细胞凋亡。 在恶性肿瘤的癌基因研究中，不少学者提出了多基因协同作用假说，认为在肿瘤的发生、发展阶段，至少有两个或两个以上功能不同的癌基因在各自发挥不同作用的同时，相互协同，促进了细胞的癌变。 癌变时DCC基因存在多种改变，杂合子缺失(loss of heterozygosity，LOH)即是其中之一。LOH反映了抑癌基因功能缺失的情况，并可能与肿瘤的分化及转移等都存在一定的关系。 国内外已有文献报道VEGF及P53表达的相关性研究，也提示两者的表达存在明显的关联。而DCC与肿瘤组织的VEGF及P53表达是否存在一定的相关性，则未晰仁大母硕士李位论义见报道。另外考虑到象P53及DCC基因在消化道肿瘤中的表达都非常明显，因此在本课题研究中侧重研究DCC与P53、vEGF在结直肠癌中表达的相关性及其与肿瘤恶性程度的关系，从而进一步为揭示肿瘤的发病规律提供分子生物学基础。 实验方法免疫组化(Immunohistoehemist叮)部分:1、标本的来派和选择 选择杭州市红十字会医院1999一2002年结直肠癌手术切除标本41例，各病例病理诊断明确，主要组织学类型包括腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌等。2、免疫组化 常规石蜡切片，应用免疫组化二步法检测结直肠癌的P53、VEGF及DCC蛋白表达，使用抗体为P53单克隆抗体及VEGF鼠抗人单克隆抗体，分别购自上海长岛和北京中山生物技术有限公司，DCC兔抗人多克隆抗体为武汉博士德公司产品，二抗使用通用型二步法免疫组化检测试剂。3、结果判定 P53蛋白位于细胞核内，阳性表达细胞多为弥漫分布;VEGF染色位于胞膜及胞浆内，癌组织内阳性细胞以弥散分布为主:DCC蛋白阳性染色主要位于细胞浆内，以上阳性染色均呈棕黄色细颗粒状。攘合醉链反应(po一ymerase ehain reaetion，PeR)部分:1、标本来源 选择杭州市红十字会医院新鲜手术标本，取材后于一20℃保存，提取DNA。取材部位包括癌变组织，正常粘膜及癌变淋巴结。2、PCR扩增 根据已有文献报道选择DCC基因VNTR位点进行PCR扩增，引物序列如下:上游5’一GATGACATTTTCCCTCTAG一3’，下游5’一GTGGTTATTGCCTTGAAAAG一3’。预计扩增的目的片段长度为Zoobp。PCR反应体系50林1，内含25pmol引物、2.smol几胡TP、2.5u几q酶、soong nNA模板和loxPeR缓冲液(MgZ+plus)。PeR反应晰江大李硕士李位份友参数:95℃smin，Xl;94oC405，52oC405，72oC605，X35:72℃10min，XI3、琼脂粉凝胶电泳井成像 直接在琼脂糖凝胶中电泳分离，澳乙锭染色，紫外光下观察电泳分离并进行照相。 结果1、免疫组化 在41例结直肠癌的病例中，通过免疫组化二步法检测几种蛋白的表达情况，其中因为野生型P53的半衰期短，我们检测到的P53为突变型P53。结果如下:突变型P53表达的阳性数为26例，占63.4%。VEGF的阳性表达共27例，占65.9%。其中，肿瘤大小、浸润的深度、淋巴结的转移情况及分化程度的不同在表达时都有不同程度的差异。在所有41例病人中，DCC表达阳性者有10例，占24.4%。在不同肿瘤大小。浸润深度及淋巴结转移情况下的表达情况亦有不同。2、PCR 在收集的23例新鲜结直肠癌标本中开展PCR实验，有18例分别在ZoobP和160bp位置出现两个条带，即为信息个体，其中有7例出现DcC基因的杂合缺失，占实验病例数的30.4%，占信息个体的38.8%。浙卜大李硕士李位伦义结论1、P53与VEGF在结直肠癌中的表达存在明显的相关性，提示P53可通过刺激VEGF表达以促进肿瘤组织的生长。2、DCC与P53及VEGF表达无明显相关性。3、在P53一vEGF共同表达的情况下，DcC蛋白表达缺失较为明显。提示结直肠癌中，在突变型P53与VEGF共同呈现阳性表达的同时，也存在抑癌基因DCC的表达下调，因此可推断结直肠癌的发生发展是癌基因和抑癌基因协同作用的结果。4、结直肠癌中DCC基因存在杂合缺失的情况，显示与肿瘤的淋巴结转移情况有明显的相关性，从而提示其对肿瘤的转移起促进作用。