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山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是制备乳腺生物反应器理想的候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本研究选用关中奶山羊胚胎和胎儿为试验对象,参照小鼠和人ESCs和EGCs建系的方法,系统比较了不同培养条件和传代方法对分离培养山羊ESCs和EGCs的影响,主要获得以下结论:1本试验共超排处理了46只/次关中奶山羊,共获得胚胎307枚,其中4~16细胞胚胎39枚,桑椹胚128枚,囊胚89枚,孵化胚51枚,平均每只山羊获得6.67枚胚胎。以Knockout DMEM为基础培养液,研究了含血清和无血清条件下山羊ICM的增殖规律。结果表明,含血清培养可以促进ICM的贴壁和增殖,有利于山羊ESCs细胞的体外传代培养,但也促进了细胞发生一定的分化。试验以Knockout DMEM+5%FBS+15%KSR的有血清培养体系,结合添加细胞因子LIF(1000 IU/mL)和bFGF(20 ng/mL),以MEF作饲养层,采用机械分割的传代方法,最高将山羊ESCs传至10代。2试验以Knockout DMEM+5%FBS +15%KSR+0.1mmol/Lβ-Me+0.1mmol/L NEA(非必需氨基酸)+2mmol/L谷氨酰胺+50IU/mL青霉素+50μg/mL链霉素+1000IU/mL LIF为基础培养液,比较了培养方法,饲养层和细胞因子对山羊ICM的贴壁增殖以及ESCs的分离与传代培养的影响,发现微滴培养法较四孔板培养更能促进ICM的贴壁和增殖,原代出现的可传代集落的比率较高;以山羊间充质干细胞作为饲养层细胞,与小鼠胎儿成纤维细胞饲养层相比较,都能维持山羊ESCs传代培养,差异不显著,P>0.05,表明山羊MSCs可以用于山羊ESCs的体外培养;试验发现联合使用LIF和bFGF比单独使用LIF维持山羊ESCs体外生长的时间长(细胞传代数较高),二者差异显著(P<0.05),与同时还添加SCF的处理组差异不显著(P>0.05),表明SCF对山羊ESCs体外培养的作用不明显。3试验发现来源于小鼠ESCs的条件培养基和大鼠NSCs的条件培养基,与Knockout DMEM培养基相比较,都能促进山羊ICM贴壁生长,差异不显著,P>0.05;比较山羊ESCs传代培养的结果表明,两种条件培养基都能促进山羊ESCs的长期传代培养,优于Knockout DMEM培养基,差异显著,P<0.05,本试验中,应用小鼠ESCs条件培养基最高将山羊ESCs传至10代。4试验采用山羊的克隆胚和孤雌激活胚分离ESCs,发现两种胚胎的贴壁率很低,胚胎细胞增殖较慢,通过比较不同发育阶段的胚胎(去透明带)的体外培养结果,发现早期桑椹胚的贴壁率稍高于囊胚,试验将ntESCs和pESCs细胞最高传至2代。5试验共处理山羊胎儿48例,成功分离得到山羊EGCs的有34例。发现以高糖DMEM为培养基,添加15% KSR的无血清培养体系比含血清的培养体系更能维持EGCs的长期传代培养,传代次数较高,但经卡方检验,15%KSR组与15%FBS组之间差异不显著(P=0.0506,P>0.05)。以高糖DMEM+15% KSR+ 0.1 mmol/Lβ-Me+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺+50 IU /mL青霉素+50μg/mL链霉素+1000IU/mL LIF+20ng/mL bFGF为基础培养液,可以较好的维持山羊EGCs的体外生长,最高将山羊EGCs传至12代。6试验首次应用Lipofectamine2000将pEGFP-N1-hTERT和pEGFP-C1-mNanog转染入山羊EGCs,发现300μg/mL的G418适宜于山羊EGCs的筛选。离散典型细胞克隆传代培养后,可得到表达绿色荧光并具有EGCs特征的细胞克隆,发现转染hTERT和mNanog基因有利于山羊EGCs体外的长期培养,表明了通过转基因建立山羊EGCs细胞系的可行性。7试验通过免疫组织化学染色和RT-PCR分析,表明山羊ESCs表达SSEA-1和Oct4, EGCs表达Nanog,SSEA-1,Oct4和TERT。试验发现悬浮培养或延迟传代的山羊ESCs和EGCs可以分化形成类胚体或成纤维样细胞,神经样细胞,脂肪样细胞等。