诱导茶树抗茶小绿叶蝉挥发物筛选体系的建立及反式—橙花叔醇诱抗机制初探

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茶树(Camellia sinensis)是亚洲重要的经济木本作物。茶小绿叶蝉是茶园首要害虫,目前缺乏高效无害化的防治技术,防治主要依赖化学农药。受害植株释放的某些挥发物可作为一种挥发性信号,引发临近未受害植株的抗虫反应。因此,筛选出具有高效诱抗功能的挥发物,可为茶小绿叶蝉的防控提供新思路。本研究以茶树12-氧-植物二烯酸还原酶基因CsOPR3作为与茶树抗茶小绿叶蝉的分子标记基因,并基于该基因在拟南芥上建立了一种诱导茶树抗茶小绿叶蝉挥发物的快速筛选体系。利用该体系和生物测定,明确了候选物质(E)-橙花叔醇的诱抗活性。并进一步对其诱抗的分子机制进行了初步研究。研究结果主要如下:1.表达分析结果表明,机械损伤、茉莉酸(Jasmonic Acid,JA)和茶小绿叶蝉处理均能提高CsOPR3的蛋白水平;茶小绿叶蝉的取食显著提高了CsOPR3基因的转录水平。克隆了茶树CsOPR3基因,开放阅读框1197 bp。构建35S::CsOPR3过表达载体,插入opr3突变体中获得两个T2代纯合品系。机械损伤处理后,过表达的CsOPR3基因补充了opr3突变体中的JA水平。同时,外源JA处理显著降低茶枝上茶小绿叶蝉数量。因此,CsOPR3基因可以作为挥发物激发子筛选体系的分子标记。2.克隆了茶树CsOPR3基因转录上游1510 bp的启动子序列。该启动子序列中含有典型的核心启动子元件(TATA-box)、增强子元件(CAAT-box)、转录起始位点以及其他防御响应顺式作用元件。基于1510 bp CsOPR3启动子与GUS报告基因的融合载体(OPR3p::GUS)获得两个独立的拟南芥品系(pL1-1和pL2-5)作为一种快速筛选体系。JA处理使得转基因拟南芥中的GUS活性提高约4倍多。同时JA处理后,pL1-1和pL2-5叶片经GUS组织化学染色呈现出显著的蓝色。以此建立了可视化的挥发物激发子的快速筛选体系。利用该筛选体系和生物测定,进一步验证了候选物质(E)-nerolidol的诱抗活性。3.外源(E)-橙花叔醇处理,提高了茶树早期防御信号MAPK和WRKY途径中的CsMAPK、CsWRKY3的转录水平和蛋白水平,并在短时间内促进了早期防御信号物质过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)的积累;提高了茶树几丁质酶合成基因CsCHIT1和CsOPR3的转录水平;促进了信号分子茉莉酸、茉莉酸异亮氨酸(Jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)和脱落酸(Abscisic Acid,ABA)的合成。本研究选定CsOPR3作为茶树抗茶小绿叶蝉的分子标记基因。以此,利用拟南芥建立了一种可视化的诱导茶树抗茶小绿叶蝉挥发物的快速筛选体系,并通过活性物质JA和(E)-橙花叔醇进行了效果验证。(E)-橙花叔醇可激活茶树早期防御信号、提高茶树防御相关基因的转录水平、促进防御信号分子的合成。上述结果为茶小绿叶蝉的无害化防治提供的新思路和理论基础。
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