甘薯病毒病害(SPVD)病原的检测方法和分子变异研究

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甘薯病毒病害(Sweet potato virus disease,SPVD)是甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potatochlorotic stunt virus,SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)协生共侵染甘薯引起的病毒病害。SPVD对甘薯产量影响极大,严重时可造成90%以上的产量损失,甚至绝收,是甘薯上的毁灭性病害。因此,建立一种简便、快速、有效的检测SPVD的方法,对于该病的预警和防治具有重要意义。本研究探索了针对甘薯及传毒烟粉虱中SPVD病原的检测技术,并对我国甘薯上SPCSV的分子变异情况进行了初步分析。获得的主要结果如下:(1)根据SPCSVHsp70基因和SPFMVCP基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单一RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、TaqDNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法。该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型。灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×10~4拷贝/μL、1.32×10~4拷贝/μL和2.47×10~4拷贝/μL。该方法可用于甘薯植株和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具。(2)建立了利用NCM-ELISA、RT-PCR和半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的方法,比较了3种检测方法的灵敏性。结果表明,NCM-ELISA最低能从16头带毒烟粉虱中检测出SPCSV;RT-PCR能从单头烟粉虱中检测出SPCSV,但需要从3头以上带毒烟粉虱中才能稳定地检测出SPCSV;半巢式RT-PCR能稳定地从单头烟粉虱中检测出SPCSV。检测灵敏性研究表明,用体外转录的RNA作为核酸模板,RT-PCR可检测的最低浓度为5.69×10~4拷贝/μL,半巢式RT-PCR为5.69×101拷贝/μL,说明半巢式RT-PCR的检测方法的灵敏性比RT-PCR高1000倍。(3)利用RT-PCR方法,对我国甘薯主产区14个省(市)的18个SPCSV分离物的外壳蛋白(CP)基因和RNA13ˊ端序列的进行了扩增、克隆和序列分析。CP基因序列分析结果显示,18个SPCSV分离物均为WA株系,CP基因之间核苷酸序列的相似性在98.4%~100%之间,说明目前侵染我国甘薯的SPCSV的CP基因分子变异较小。RNA13ˊ端序列分析结果表明,安徽、江苏2、重庆分离物之间的核苷酸序列相似性高达99%以上,属WA株系,浙江2分离物与其它分离物之间相似性为84.4%,属EA株系,说明我国至少存在SPCSV的两个株系类型。
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