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体外受精技术作为胚胎工程研究领域的一项关键技术,广泛地应用于家畜繁殖领域,为家畜遗传保种等提供了技术保障。绵羊是我国重要的家畜之一,也是家畜体外受精最早研究的动物,但其体外受精效率却明显低于其他家畜。除此之外,干细胞在家畜领域具有非常大的潜在应用价值。绵羊类干细胞的体外培养,不仅可以作为研究哺乳动物发育的体外模型,也可以用于治疗和育种,应用前景广阔,但目前绵羊干细胞的研究仍处于起步阶段。溶血磷脂酸(Lysophosphatidicacid,LPA)是一种小分子甘油磷脂,在多种动物细胞中具有生长因子和激素样活性。LPA通过结合其耦联G蛋白的各种受体,激活下游多条信号通路,产生生物学效应,如促进细胞增殖、分化、迁移、侵袭、黏附和形态发生等。有研究表明,LPA可促进卵母细胞成熟,提高胚胎发育率,对细胞增殖有促进作用。通过在体外受精及囊胚接种细胞培养过程中添加LPA,探究LPA对绵羊体外受精的促进机制以及囊胚接种细胞培养的影响,为家畜体外受精及囊胚接种细胞建系提供参考。本研究首先探讨LPA对绵羊体外受精早期胚胎发育的影响。我们选取了两种成熟液,成熟液1与成熟液2,与两种SOF液进行组合,通过比较不同体系间的成熟率、卵裂率和囊胚率,最终找到最优的体外受精的体系即成熟液1+SOF2。然后,我们在绵羊卵母细胞体外成熟、体外受精和受精卵体外培养过程中添加不同浓度的LPA,统计不同LPA浓度对体外受精过程中成熟率、卵裂率及囊胚率的影响。结果显示,当LPA浓度为0.1μM、1μM及10μM之间时,随着LPA浓度的增加,绵羊卵母细胞体外成熟率、卵裂率、囊胚率逐渐上升,且囊胚形态正常;但当LPA浓度达到15 μM时,成熟率、卵裂率、囊胚率出现下降,并且囊胚形态发生异常,胚胎内细胞团聚集不正常,囊胚内部出现分区,不能发育成为优质的囊胚。为了检测在不同浓度LPA的刺激下,LPARs及干性标记基因OCT-4与CDX-2在早期胚胎中的表达量,我们通过实时定量PCR检测了LPAR1 LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、OCT-4 与 CDX-2 在 2 细胞期、4 细胞期、8细胞期、桑葚胚期和囊胚期中的表达情况。结果显示,在不同LPA浓度下,LPARs在早期胚胎各个时期均有表达,其中LPAR2的表达量明显高于其他5种受体的表达量,LPAR4表达量仅低于LPAR2,LPAR1与LPAR3表达量较接近,LPAR5与LPAR6表达量较为接近,但LPAR1、LPAR3、LPAR5与LPAR6表达量极低。LPAR2与LPAR4表达量在2细胞时期到囊胚期呈现上升趋势,且当LPA浓度为0-10μM时,随着LPA浓度的增加而增加,而当LPA浓度为15μM时,二者的表达量却出现抑制。为了探讨LPA浓度对囊胚接种细胞培养的影响,我们在囊胚接种细胞培养体系中添加不同浓度的LPA,观察不同体系下囊胚接种细胞的生长情况,通过免疫荧光染色与实时荧光定量PCR来检测细胞中干细胞多能性标志物OCT4及滋养层干细胞标志基因CDX2的表达。我们选取GFF为饲养层,2i为基础培养体系,与Wnt-3a、hLif、Forskolin及LPA组合形成8种培养体系。结果显示只添加2i培养液囊胚接种细胞生长缓慢,且出现分化现象;培养体系添加2i与Wnt-3a,贴壁囊胚长出扁平片状结构,单层细胞下有液体积聚成穹窿状结构,与滋养层干细胞相似,呈OCT4与CDX2阳性;体系为2i加hLif,贴壁囊胚细胞克隆较为致密,其形态类似于小鼠胚胎干细胞,成三维立体生长,OCT4呈阳性CDX2呈阴性。在2i与hLif培养体系中添加Forskolin,囊胚接种细胞呈扁平片状生长,呈OCT4与CDX2阳性。取不同浓度LPA与2i、hLif、Forskolin组合,发现随着LPA浓度的增加,囊胚接种细胞呈扁平片状生长,细胞克隆的细胞核和细胞轮廓清晰,片状细胞克隆边缘出现增厚,甚至出现类似于牛胚胎干细胞的穹窿状结构,出现形成滋养层干细胞的趋势。在OCT4与CDX2的免疫荧光染色中,荧光强度在一定程度上随着LPA浓度的增加而增强。实时荧光定量PCR结果显示,OCT4与CDX2表达量随LPA浓度的增大而增大,但过高浓度LPA却会抑制OCT4与CDX2表达量。综合上述实验结果,可见LPA在绵羊体外受精早期胚胎发育及囊胚接种细胞培养中有着重要作用,本研究为家畜体外受精及干细胞研究提供一定的理论依据。