论文部分内容阅读
目的本实验采用体外原代培养大鼠海马神经元,通过建立缺糖缺氧(Oxygen and glucose deprivation,OGD)神经元损伤细胞模型,观察藁本内酯(Z-ligustilide,LIG)对OGD损伤神经元的保护作用及可能的作用机制。方法原代培养海马神经元的鉴定1取新生SD大鼠的海马区域进行海马神经元的原代培养2采用尼氏染色液对海马神经元进行染色3大鼠微管相关蛋白(MAP-2)免疫荧光鉴定大鼠海马神经元藁本内酯对缺糖缺氧损伤海马神经元的保护作用1采用三气培养箱(94%N2,5%CO2,)和低糖培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)连用的方法建立OGD模型模拟体内脑缺血;MTT(3-[4,5 dimethyl(thiozol-2-yl)]-2,5-dipheryl tetradinm bromide)法和乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法分别检测藁本内酯对OGD损伤后海马神经元细胞存活率及LDH释放量的影响。2倒置显微镜检测细胞生长状态及OGD损伤后海马神经元细胞形态的变化3透射电子显微镜观察OGD损伤海马神经元超微结构的变化4采用Hochest 33258染色观察细胞凋亡形态5利用FITC-Annexin V/propidium iodide(PI)双染法流式细胞术定量检测细胞凋亡率藁本内酯对缺糖缺氧损伤海马神经元保护作用机制的研究1采用Fluo-3/AM荧光探针染色流式细胞术检测藁本内酯对OGD损伤后海马神经元钙离子内流的影响2采用DCFH-DA荧光探针染色流式细胞术检测藁本内酯对OGD损伤海马神经元活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成变化的影响3采用JC-1染色流式细胞术检测藁本内酯对OGD损伤海马神经元线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的影响4 Western-Blotting法检测藁本内酯对OGD损伤海马神经元细胞色素C转移(Cyt C)的影响5 Western-Blotting法检测藁本内酯对OGD损伤海马神经元凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的影响6 Western-Blotting法检测藁本内酯对OGD损伤海马神经元凋亡执行蛋白Caspase-3的影响藁本内酯对OGD损伤海马神经元通路的筛选1 FITC-Annexin V/PI双染法流式细胞术检测PI3K/Akt信号通路对凋亡的影响2 Western-Blotting法检测PI3K/Akt信号通路对其下游蛋白Bad表达的影响3 Western-Blotting法检测PI3K/Akt信号通路对凋亡执行蛋白Caspase-3表达的影响结果原代培养海马神经元的的鉴定1尼氏染色液染色后,海马神经元呈淡紫色,染色结果为阳性。2 MAP-2免疫荧光结果显示,海马神经元为荧光绿色,实验结果显示阳性,说明海马神经元的原代培养成功。藁本内酯对缺糖缺氧损伤海马神经元的保护作用1采用MTT法检测细胞活力,结果表明,与OGD模型组相比,不同浓度藁本内酯处理组显著提高OGD损伤的海马神经元的细胞存活率。2倒置显微镜观察下,可见OGD模型损伤组海马神经元细胞皱缩,脱落,细胞浆失水浓缩呈空泡样改变,突触变少,而藁本内酯处理组细胞形态均一,细胞脱落较少,突触完整。3透视电镜结果显示OGD模型组的细胞超微结构具有明显的凋亡特征,即凋亡小体的出现。与OGD模型组相比,藁本内酯给药组细胞器损伤形态显著改善,细胞表面有微绒毛,核大,核仁明显,未观察到凋亡小体的存在。4 LDH检测结果显示,与OGD模型组相比,藁本内酯处理组可显著减少OGD所致的海马神经元内LDH的释放量。5 Hochest33258染色结果显示,空白对照组的海马神经元细胞核被染成微弱蓝色荧光,而OGD模型组细胞胞核则呈现出强荧光蓝色,同时可观察到凋亡的细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染;与模型组相比,藁本内酯给药组海马神经元的细胞核呈现微弱的蓝色荧光,凋亡细胞数明显减少。6 FITC-Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,藁本内酯给药组可显著地减少OGD诱导的细胞凋亡率(p<0.01)。藁本内酯对缺糖缺氧损伤海马神经元保护作用机制的研究1藁本内酯抑制了OGD诱导所致海马神经元钙离子的内流。2藁本内酯抑制了OGD诱导所致海马神经元ROS的生成。3藁本内酯抑制了OGD诱导所致海马神经元线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)的下降。4藁本内酯抑制了OGD诱导所致海马神经元中Cyt C的从线粒体释放入胞浆的量。5藁本内酯抑制了促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值。6藁本内酯抑制了OGD诱导所致海马神经元凋亡蛋白cleaved Caspase-3的过表达藁本内酯对OGD损伤海马神经元通路的筛选1 PI3K/Akt信号通路的激活参与了藁本内酯对抗OGD损伤海马神经元凋亡的作用。2藁本内酯激活了PI3K/Akt信号通路,并参与抑制其下游蛋白Bad的过表达抑制细胞凋亡。3藁本内酯激活了PI3K/Akt信号通路,并参与抑制了Caspase-3蛋白的过表达从而抑制了OGD诱导所致海马神经元的凋亡。结论实验结果表明,缺糖缺氧可致海马神经元的凋亡;藁本内酯通过抑制细胞凋亡保护缺糖缺氧诱导海马神经元的损伤。其神经保护作用可能通过减少OGD诱导所致海马神经元内钙离子内流,ROS的生成,线粒体膜电位的下降,减轻氧化损伤的程度,进而抑制海马神经元的凋亡。分子机制相关研究表明,藁本内酯激活了PI3K/Akt信号通路,参与抑制Cyt C由线粒体的释放,抑制其下游蛋白过Bad的过表达以及抑制凋亡执行蛋白Caspase-3的过表达从而达到抗凋亡的目的。