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第一部分胰腺癌组织中差异表达miRNA的筛选及验证目的:利用miRNA芯片技术筛选出人胰腺癌组织及癌旁组织之间差异表达的miRNA,并进行数据分析,以期为胰腺癌的分子生物治疗提供理论依据和潜在靶点。方法:(1)收集39例胰腺癌患者标本及其配对的癌旁组织,并记录患者的临床病理特征。(2)选取其中3例胰腺癌组织及其配对癌旁组织行Affymetrix miRNA芯片检测,分析miRNA的差异性表达,筛选出上调和下调有显著差异的miRNA。(3)挑选5种差异表达显著的miRNA,扩大样本量,运用qRT-PCR检测其在胰腺癌组织中的表达情况,包括2个在胰腺癌中表达上调的miRNA基因(miR-422a和miR-628-5p)和3个胰腺癌中表达下调的miRNA基因(miR-557、miR-563和miR-658)。(4)根据miR-557在肿瘤组织中的表达水平,分析miR-557的表达水平与胰腺癌患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、血管侵犯和临床分期等病理特征的关系。结果:(1)通过检测3组胰腺癌组织样本,Affymetrix miRNA芯片筛选获得558个差异表达的miRNA,其中癌组织中表达上调的有213个,表达下调的有345个。(2)经 qRT-PCR 验证的 5 个 miRNAs(miR-422a、miR-628-5p、miR-557、miR-563和miR-658),其表达情况与芯片结果符合,挑选其中差异表达倍数最显著的miR-557作为进一步研究对象。(3)miR-557在胰腺癌组织中显著低表达,经统计分析,miR-557表达水平下降与肿瘤的分化程度较低、淋巴结转移、血管侵犯和TNM分期偏晚均有显著相关性(P<0.05),但与患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位无关(P>0.05)。结论:本实验通过miRNA芯片技术筛选获得胰腺癌组织中miRNA的差异表达谱。miR-557在胰腺癌组织中呈显著低表达,并与胰腺癌患者的恶性临床病理特征密切相关。第二部分miR-557对胰腺癌细胞恶性生物学行为的影响目的:观察miR-557过表达对胰腺癌细胞恶性表型的影响并讨论其作用机理。方法:(1)qRT-PCR检测3种胰腺癌细胞株和正常胰腺导管上皮细胞中miR-557的表达水平。(2)构建过表达miR-557的慢病毒表达载体LV-miR-557,侵染胰腺癌PANC-1细胞,获得稳定转染miR-557的PANC-1细胞株。(3)应用CCK8、Annexin V-FITC/7-ADD双染、Transwell实验及划痕实验等方法观察miR-557对胰腺癌细胞体外增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响。(4)免疫荧光检测miR-557对EMT标记物及相关调控蛋白表达变化的影响。(5)构建荷瘤裸鼠模型。裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对胰腺癌细胞体内成瘤能力的影响,裸鼠肺转移模型观察miR-557对胰腺癌远处转移能力的影响。结果:(1)3种胰腺癌细胞中miR-557的表达水平均较正常胰腺导管上皮细胞显著降低(P<0.01)。(2)qRT-PCR分析结果显示,转染慢病毒过表达载体后PANC-1细胞中miR-557的表达水平显著提高,表明慢病毒载体构建成功。(3)CCK8检测细胞增殖活性,结果表明,培养48小时后,miR-557过表达组的PANC-1细胞表现出明显的增殖抑制作用。双染法流式细胞术检测凋亡结果显示,miR-557对胰腺癌细胞的凋亡无明显影响(P>0.05)。Transwell侵袭实验结果显示,与对照组相比,miR-5 5 7过表达组PANC-1细胞的穿膜细胞数明显减少(P<0.01),表明其能明显减弱胰腺癌细胞的体外侵袭能力。划痕实验结果显示miR-557过表达后PANC-1细胞的迁移距离显著缩短(P<0.01),划痕修复能力减弱,提示miR-557能明显抑制胰腺癌细胞的迁移活动能力。(4)免疫荧光检测结果显示,miR-557过表达后上皮型标志物E-cadherin的表达明显增强,而间质型标志物N-cadherin的表达明显减弱,调控分子p-Smad2/3的表达明显减弱,表明miR-557可能通过负调控p-Smad2/3的表达逆转胰腺癌的EMT进程。(5)体内实验中,与对照组相比,miR-557过表达组的皮下成瘤时间明显延长,并能显著抑制胰腺癌细胞的体内成瘤能力,此外,miR-557对裸鼠体内胰腺肿瘤的远处转移也具有明显抑制作用。结论:miR-557在胰腺癌细胞系中低表达,并且上调miR-557的表达不仅能够显著抑制胰腺癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,还能遏制荷瘤裸鼠体内的肿瘤生长和远处转移。第三部分miR-557调控胰腺癌恶性生物学行为的机制研究目的:预测miR-557的靶基因并进行筛选、验证,揭示miR-557调控胰腺癌增殖和侵袭的潜在分子机制。方法:(1)运用生物信息分析技术预测miR-557的候选靶基因。(2)Western blot法检测miR-557过表达对候选靶基因蛋白水平表达的影响。(3)构建EGFR 3’-UTR野生和突变型重组载体,双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与EGFR的靶向关系。(4)构建EGFR过表达质粒载体,通过Rescue实验策略进行增殖、迁移、侵袭等相关功能测验以揭示其调控机制,并分析EMT标志物的表达变化。结果:(1)采用生物信息学方法分析推测EGFR为miR-557的靶基因之一。(2)Western blot结果表明过表达miR-557可以阻遏EGFR蛋白的表达。(3)双荧光素酶基因报告实验结果显示,miR-557 mimics 和野生型重组载体psiCHECK-2-EGFR-UTR共转染时,荧光素酶活性明显受到抑制(P<0.05),提示miR-557可以通过作用于EGFR的3’-UTR区,负向调控其表达。(4)CCK8实验结果显示,相比于单转染miR-557组,共表达miR-557/EGFR组中PANC-1细胞的增殖活性明显增强(P<0.05),且与对照组比较已无显著性差异(P>0.05),提示EGFR能抵消miR-557诱导的增殖抑制作用。Transwell实验的结果显示,转染EGFR质粒后,共转染miR-557/EGFR组与单转染miR-557组比较,穿膜细胞数明显增多,而与对照组相比显著性减少,差异有统计学意义(P<0.05),提示EGFR仅能部分阻断miR-557抑制侵袭的作用。划痕实验结果显示,相比于对照组,共转染miR-557/EGFR组细胞的迁移距离显著缩短(P<0.05),而与单转染miR-557组相比迁移距离明显增宽,同样提示EGFR仅部分减弱了 miR-557抑制肿瘤细胞迁移活动的能力。(5)免疫荧光结果显示,与单转染miR-557组相比,共转染miR-557/EGFR组E-cadherin的荧光强度变弱,N-cadherin和p-Smad2/3的荧光强度明显增强;与对照组相比,共转染miR-557/EGFR组E-cadherin的荧光强度增强,N-cadherin的荧光强度减弱,而p-Smad2/3的荧光强度差异不明显(P>0.05)。结论:EGFR是miR-557的靶基因之一,miR-557通过负向调控肿瘤细胞内EGFR的表达从而影响胰腺癌的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学表现,此外,miR-557还可能通过其他靶基因介导的分子效应影响胰腺癌的EMT变化。