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本研究通过ISSR与ITS分子标记技术对皖北桔梗主产区种质资源遗传多样性进行研究,旨在探索有效地用于鉴别桔梗种质的遗传标记,并分析桔梗种质的遗传多样性现状,建立含有丰富原始材料的种质资源库,并最终用于指导新品种的选育。主要结果如下: 1、本研究首次应用ISSR与ITS分子标记技术对桔梗种群种植资源遗传多样性进行研究,筛选出10条适合桔梗科的ISSR引物,扩增多态性较高,优化出桔梗科ITS引物;建立了ISSR与ITS最佳反应体系及扩增程序,稳定可靠,实验重现性良好,为后续桔梗及其他作物ISSR、ITS标记提供参考。 2、通过简单重复序列扩增(ISSR,Inter-simple Sequence Repeat)分子标记方法研究皖北桔梗遗传多样性。10个ISSR引物对105个样本扩增获得97条带,其中74个为多态性带,多态性位点比率为76.29%。遗传多样性指数方面:Shannon多样性指数为0.3581±0.2506,Neis基因多样性为0.2326±0.1777,观测等位基因数为1.7629±0.4275,有效等位基因数为1.3785±0.3349,种群总的遗传多样性为0.2327±0.0318,种群间遗传多样性为0.1967±0.0236,各种群间遗传分化指数为0.1547,种群间每代个体的基因流(Nm)为2.7330,表明桔梗种群具有较高的遗传多样性;利用分子方差变异分析(AMOVA)结果:总的遗传变异中有13.98%的变异发生在种群间,有86.02%的变异发生在种群内,种群间与种群内的变异均显著(P<0.01),总的遗传变异主要来自于种群内部,且种群间遗传分化程度中等偏弱;根据Nei遗传距离利用UPGMA法构建的种群遗传关系聚类图说明5个种群间的聚类结果和地理间距正相关;桔梗单样本聚类结果显示,单倍型比率为100%,且各单倍型在关系图中分散混杂,与种群关系之间缺乏对应的遗传结构,且有一些的样本表现出了较高的遗传多样性。 3、通过内转录间隔区(ITS,Internal Transcribed Spacer)分子标记方法研究皖北桔梗遗传多样性。从76个个体中均获得了535 bp的桔梗ITS序列,总体上GC含量达到62.61%,有明显的G+C偏向性;序列间差异仅为个别碱基,变异类型大部分为颠换,少数为转换,总体的转换与颠换的比为R=0.345,共有9个多态变异位点;总的单倍型多样性为0.44982,核苷酸多样性是0.00113,平均配对差异是0.60249;种群内遗传距离最大的是毫州蕉城区种群,为0.00259,种群间遗传距离最大的是李兴镇种群与蕉城区种群的遗传距离,为0.00184,基于种群间遗传距离得到的聚类分析图显示各种群关系混杂,遗传距离和地理间距不存在显著的相关性;分子方差变异分析结果显示88.14%的差异来自种群内,11.86%的差异来自种群间,核苷酸分化系数Nst=0.10811,基因的分歧系数Gst=0.12240,表明总的遗传变异主要来自种群内部;基因流Nm=1.79,表明种群间存在有效基因交流,FST值为0.11861,且P<0.01,表明种群间遗传分化程度达到中等偏弱;Tajimas D及Fus Fs检验均得到负值,歧点分布图为一单峰;共定义的6个单倍型间的遗传距离范围为0.00187-0.01130,共享单倍型是Hap_2,占个体总数的71.05%;TCS1.21分析的单倍型网络分布图和贝叶斯树均表明各单倍型间并没有按5个种群进行分布,表明各种群间没有进行分化。 4、通过2种分子标记的研究,显示皖北桔梗种群遗传多样性较高,有较高多态性;种群结构方面,总的变异主要来自种群内部,种群内的遗传分化大于种群间,种群间有有效的基因交流,表明皖北各种群间无显著分化,分化程度仅中等偏弱;各种群间遗传距离较小,相似性较高,聚类结果显示各种群遗传距离和地理间距相关;在单倍型分析中,显示有遗传多态性较高的样本,可作为遗传育种材料,且各单倍型在关系图中混杂,和种群间缺乏对应,说明各种群间缺乏明显的遗传结构,没有发生显著的种群分化。 5、本文研究数据表明使用ISSR技术对桔梗种群的遗传多样性的分析比运用ITS片段更具优越性,但ITS可提供若干ISSR不能检测的的数据,所以2种方法相结合,可得到更全面、准确的分析结果。