为克服由于人的补体调节蛋白(CRP)在转基因动物体内广泛表达给宿主带来的不利影响，我们采用受精卵显微注射技术，将本室构建的两种包含有血管内皮细胞组织特异性调控元件、目的基因自身第一个内含子及人CRPcDNA序列外源基因导入小鼠受精卵的原核中，通过胚胎移植建立血管内皮细胞组织特异性高效表达人DAF、CD59转基因小鼠，以研究人DAF、CD59基因在转基因小鼠血管内皮细胞组织特异性表达规律，检测这些转基因小鼠抗超急性排斥反应(HAR)能力并探讨外源基因在转基因动物传代过程中的遗传规律。为此本实验组做了如下工作。 第一部分 血管内皮细胞组织特异性表达人DAF、CD59转基因小鼠的制备 目的 制备原代血管内皮细胞组织特异性表达人DAF、CD59转基因小鼠。方法 用限制性内切酶Xba Ⅰ／BamH Ⅰ／Sca Ⅰ酶切本室构建含有人DAF cDNA外源基因的质粒，回收纯化3.7kb DNA片段，依次包括人ICAM-2启动子序列，人DAF cDNA(含人DAF基因第一个内含子)及SV40 splice／polyA终止信号。用限制性内切酶Bgl Ⅱ／Sma Ⅰ酶切本室构建含有人CD59cDNA外源基因的质粒，回收纯化2.2kb DNA片段，依次包括人ICAM-2启动子序列，人CD59基因第一个内含子，人CD59 cDNA及BGH polyA终止信号。将上述两种片段混合配制成注射用溶液(各自浓度为5μg／ml)。自制显微工具(包括持卵针管、注射针管、移卵管)。4～6周龄雌鼠经超排卵后分别与正常雄鼠交配，制备超排卵小鼠。同时以自然发情的正常雌鼠与结扎输精管的不育雄鼠合笼交配，以准备假孕母鼠。实验日，从超排卵小鼠输卵管收集受精卵，选择原核清晰的受精卵，向雄原核中注入前述外源基因溶液，注射量约1～2pl。天津医科大学博七学位论文摘要将注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，待分娩。结果4一6周龄80只雌鼠经超排卵后分别与正常雄鼠交配，共得到受精卵2100余枚，选取原核清晰的受精卵1700枚用于显微注射，1300枚受精卵注射后仍健康，注射后存活受精卵的比率为76.5%(1300/1700)，将它们分别移植入50只假孕母鼠的输卵管中，其中30只受孕，足月后共产生原代鼠135只，移植受精卵的发育率为10.3%(135八300)。结论通过显微注射方法，成功制备了转基因原代鼠。第二部分血管内皮细胞组织特异性表达人DAF、CD59转基因小鼠的筛选 目的从原代鼠中筛选出血管内皮细胞组织特异性表达人DAF、CD59转基因小鼠。方法提取原代小鼠基因组DNA，以人ICAM一2启动子序列为模板，用PCR方法进行外源基因整合初步筛选，并进一步对PCR检测中出现特异条带小鼠基因组DNA行S。磁hem印迹杂交分析。提取有外源基因阳性整合小鼠白细胞总RNA行Rl’- PCR以获取外源基因mRNA水平表达阳性小鼠，将实现转录的转基因鼠白细胞分别与FITC标记小鼠抗人CD59单克隆抗体、PE标记小鼠抗人DAF单克隆抗体孵育后行流式细胞检测，以证实蛋白质水平表达。用兔抗人CD59、DAF抗体作一抗，免疫组织化学技术观察人CD59、DAF基因在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果经PCR筛选55只小鼠样品出现特异条带，对这些小鼠行Southem印迹杂交，14只出现0.476kb杂交带，26只出现1 .6kb杂交带，其中5只出现1 .6kb、0.476kb两条杂交带，双基因整合率为4%(5/135)。Rl’- PCR及流式细胞术对外源基因整合阳性鼠检测证实其中的2只双基因整合小鼠(均为雌性)、3只单人DAF基因整合小鼠(均为雄性)、2只单人CD59基因整合小鼠(均为雄性)获得转录及蛋白质水平表达，蛋白质水平表达强度为人CD59、DAF在人白细胞表达强度的70%一95%。双基因转基因效率1%(2/135)。免疫组化显示人DAF、CD59在转基因鼠肾脏、肝脏、心脏等器官组织切片上有表 。2。天津医科大学博士学位论文摘要达，且表达限于血管内皮细胞。结论本实验成功地建立了血管内皮细胞组织特异性表达人CD59、DAF转基因小鼠(包括2只血管内皮细胞组织特异性表达人CD59心AF联合转基因小鼠)。 第三部分、血管内皮细胞组织 特异性表达人DAF，CD59转基因小鼠的传代和表达检测 目的获得子一代(F1代)转基因鼠并探讨外源基因在转基因鼠传代中的遗传规律。方法将2只雌性双基因转基因小鼠与处在生育力旺盛期健康同种雄性小鼠进行交配;从雄性人DAF基因、人CD59基因转基因鼠中选取表达最好的分别与处在生育力旺盛期健康同种雌性小鼠进行交配，Fl代小鼠筛选方法同前。结果与人CD59基因转基因鼠交配的雌性小鼠产子14只，7只外源基因整合阳性，其中5只蛋白质水平表达阳性;13只转人DAF基因Fl代小鼠中6只整合阳性，5只实现了蛋白质水平表达。免疫组化显示人DAF、CD59在Fl代转基因鼠肾脏、肝脏、心脏等器官组织切片上有表达，且表达亦限于血管内皮细胞。由于其他原因未获得人DAF/CD59基因联合转基因Fl代鼠。结论在转基因小鼠与普通小鼠交配的传代过程中，产生的Fl代小鼠中有50%的阳性整合鼠，表明稳定整合的外源基因与宿主体内的自身基因一样也依据孟德尔遗传规律遗传到Fl代。但整合的外源基因在Fl代小