论文部分内容阅读
水稻是我国乃至全世界最主要的粮食作物之一,也是重要的单子叶模式植物。深入挖掘参与水稻生长发育调控的转录因子,有利于培育新型高产优质水稻品种。NF-Y家族转录因子普遍存在于真核生物中,在植物中参与调控胚胎发育、根系生长、抽穗开花等生理过程。OsNF-YA8是水稻NF-Y家族中的种子特异表达基因,其功能尚不清楚。本研究以OsNF-YA8过表达和功能缺失材料为研究对象,分析其在水稻生长发育中的功能。主要结果如下:1、NF-Y转录因子OsNF-YA8属于NF-YA亚家族,主要在水稻种子中表达。与NF-YA家族其他成员相比,OsNF-YA8蛋白结构的保守性相对较低;进一步的进化分析表明OsNF-YA8可能是在稻属中新形成的基因。2、为研究OsNF-YA8的生物学功能,我们构建OsNF-YA8的过表达和CRISPR/Cas9功能缺失水稻转基因材料。获得了四个玉米泛素化启动子驱动的OsNF-YA8过表达（mUbi::OsNF-YA8-OE）以及两个水稻泛素化启动子驱动的过表达（o Ubi::OsNF-YA8::Flag）转基因系。实时荧光定量 PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）结果表明两种过表达材料中OsNF-YA8表达都显著上调。此外,免疫印迹检测法（Western Blot,WB）可以检测到OsNF-YA8-Flag转基因材料中明显的Flag信号。此外,获得了两个功能缺失突变体nf-ya8-1（2bp缺失）和nf-ya8-2（4bp缺失）,突变导致OsNF-YA8蛋白的移码突变,翻译提前终止。3、农艺性状考察分析发现,与野生型相比,oUbi:OsNF-YA8::Flag过表达系在幼苗期、抽穗期和成熟期株高均显著变矮;转基因材料成熟期节间显著变短。进一步节间树脂切片结果显示CsNF-YA8过表达系的细胞长度显著变短。以上结果表明OsNF-YA8过表达导致的植株变矮可能是节间细胞伸长受抑制引起的。4、本研究采用转录组测序技术对OsNF-YA8过表达和野生型抽穗期水稻节间组织进行转录组测序,鉴定到2014个差异表达基因。通过GO分析发现代谢、细胞周期和发育相关基因被富集,KEGG分析显示OsNF-YA8异位表达会影响茎秆中淀粉代谢、二萜类化合物生物合成以及光周期等通路。5、高效液相色谱分析赤霉素含量显示,OsNF-YA8过表达株系中活性赤霉素GA4的含量显著下降。此外,外施GA能部分恢复OsNF-YA8过表达导致的矮化表型。RT-qPCR分析发现,GA生物合成相关基因,如CPS1、GA20ox1、GA20ox2、GA20ox7等在o Ubi::OsNF-YA8::Flag中表达量都显著下降,暗示了 OsNF-YA8可能通过影响GA的生物合成调控水稻株高。6、双荧光素酶报告基因实验（Dual Luciferase Reporter）以及染色质免疫沉淀定量PCR（Chromatin Immunoprecipitation Quantitative PCR,ChIP-qPCR）结果表明:OsNF-YA8可以直接结合在GA合成相关基因CPS1、GA20ox1和GA20ox2启动子区域,并抑制这些基因表达。7、OsNF-YA8调控水稻种子的发育。考种结果显示:（1）OsNF-YA8功能缺失突变体结实率显著下降;（2）OsNF-YA8过表达系或功能缺失突变体籽粒都变长,厚度变薄,但千粒重无明显差异;（3）CsNF-YA8过表达或突变都会导致水稻垩白粒率和垩白度显著增加;（4）RT-qPCR结果表明发现蔗糖和淀粉合成代谢相关基因（如SPS1、BE1等）的表达显著改变。8、此外,OsNF-YA8异位表达还参与光周期过程,在短日照条件下OsNF-YA8过表达导致抽穗期显著晚于野生型;转录组和RT-PCR结果表明水稻抽穗开花进程的关键基因Hd3a、RFT1、CO3、FTL6和 FTT1 都下调,DTH8/OsNF-YB11 上调;进一步双荧光素酶报告基因实验以及ChIP-qPCR结果显示OsNF-YA8可以直接结合在抽穗开花相关基因Hd3a启动子区域,并抑制其表达。9、转录组和RT-PCR结果显示水稻NF-Y家族其他基因的表达在OsNF-YA8过表达材料中发生明显变化,而酵母双杂实验和双分子荧光互补实验表明OsNF-YA8可以和OsNF-YC4、OsNF-YC7在体外互作,暗示NF-YA8异位表达可以和其他NF-Y家族成员互作,共同参与下游基因的表达调控。综上所述,转录因子OsNF-YA8在水稻生长发育中具有重要调控功能,OsNF-YA8异位表达直接或间接抑制茎秆中GA合成相关基因的表达,抑制细胞伸长来调控水稻株高;还可以通过调控Hd3a的表达影响短日照条件下的抽穗;此外,OsNF-YA8可以通过调控淀粉合成相关基因的表达来调控水稻籽粒的发育。