论文部分内容阅读
不饱和脂肪酸在增加生物膜的流动性中发挥重要作用，其在生物膜中的含量与机体对低温逆境的抗性有极强的相关性。植物不饱和脂肪酸合成是依靠脂肪酸去饱和酶完成的，位于内质网上的油酸去饱和酶FAD2和亚油酸去饱和酶FAD3是植物产生多聚不饱和脂肪酸的关键酶。油酸去饱和酶FAD2的重要功能就是向油酸(C 18∶1)引入第二个双键，提供质膜结构所需的亚油酸(C18∶2)多元不饱和脂肪酸；亚油酸去饱和酶FAD3的重要功能就是提供质膜结构所需的亚麻酸(C18∶3)多元不饱和脂肪酸。研究结合生物信息学和分子生物学知识，利用现有的杨树基因组EST序列库资源，通过同源序列搜索，经过多次拼接合并获得了理论的杨树油酸去饱和酶基因和亚油酸去饱和酶基因cDNA序列，利用RT-PCR成功扩增了毛白杨(Populus tomentosa)PtFAD2和PtFAD3基因全长编码序列cDNA(GenBank注册号：DQ316788和DQ354393)；PtFAD2基因cDNA全长1276bp，开放阅读框编码388个氨基酸；PtFAD3基因cDNA全长1199bp，开放阅读框编码383个氨基酸。在克隆得到PtFAD2基因的基础上，构建了植物超量表达载体pBin438-PtFAD2和植物RNAi表达载体pBI121-PtFAD2-RNAi；在克隆到PtFAD3基因的基础上构建了植物超量表达载体pBI121-PtFAD3和RNAi表达载体pBI121-PtFAD3-RNAi。并用改进冻融法将各表达载体分别导入根癌农杆菌GV3101。通过农杆菌介导的叶盘法对84K杨进行了遗传转化，经卡那霉素多步筛选得到抗性转化植株，经过分子检验证明含有目的基因的T-DNA已经整合进84K杨基因组。目的基因的转录表达相对含量经real-time PCR试验分析，转PtFAD2超量表达的转基因系F2-100、F2-35与野生型植株相比，PtFAD2基因转录量提高了109％和74％；而转PtFAD2 RNAi的2R-11、2R-31转基因系PtFAD2基因转录量只有野生型的36％和54％。转PtFAD3超量表达的F3-17、F3-62转基因系与野生型相比，PtFAD3基因转录量提高了60％倍和150％倍；RNAi转PtFAD3的3R-14、3R-20转基因系与野生型相比，PtFAD3基因转录量是野生型的40％和46％。基因表达量分析表明，超量表达转基因提高了相应基因的转录量，而RNAi转基因则降低了基因的转录量。提取转基因植株叶片脂肪酸，气相色谱分析了各组分比例，结果显示超量表达的转基因植株叶片中不饱和脂肪酸含量有一定程度的提高，RNAi抑制表达转基因植株中不饱和脂肪酸含量得到了降低。F2-35和F2-100转基因系与野生型对照均值相比，亚油酸(C 18∶2)含量提高5.7％和7.1％；亚麻酸(C 18∶3)含量提高3.2％和2.1％；2R-11和2R-31号转基因系与野生型对照相比，叶片中的亚油酸(C 18∶2)含量降低19.3％和14.7％，亚麻酸(C 18∶3)含量降低了5.3％和6.1％，而油酸(C 18∶1)含量提高了9.5％和8.5％。F3-17和F3-62的转基因系亚麻酸(C 18∶3)含量提高7.6％和8.7％；3R-14和3R-20号的转基因系与野生型均值相比，叶片中的亚麻酸(C 18∶3)含量降低了5.9％和7.1％；亚油酸(C 18∶2)含量升高了2.2％和3.2％；油酸(C 18∶1)含量提高了2.8％和3.6％。在植株高度70cm左右生长期时，将生长环境温度由25℃迅速降至4℃，低温处理24h后，F2-35和F2-100转基因系未受害率为100％和80％，F3-17和F3-62转基因系植株未受害率为71.4％和75％，野生型对照未受害率为25％，而RNAi抑制的转基因系2R-11、2R-31、3R-14、3R-20植株低温均全部受害。结果初步表明超量表达转基因系未受害率高于野生型植株，而RNAi转基因系未受害率比野生型植株低。春季扦插小苗生长到具有3-5片叶的萌芽期，将其从25℃的生长温度环境移至-4℃低温冷冻3h。冷冻处理后植株存活情况经统计分析，结果表明野生型植株与F2-35、F2-100、F3-17和F3-62转基因系之间的存活率存在显著差异，其中转PtFAD3基因的超量表达转基因系F3-62和F3-17存活率最高，存活率为73.3±5.7％和70±5.7％；转PtFAD2基因的超量表达转基因系F2-100和F2-35存活率其次，存活率为60±5.7％和56.6±3.3％；野生型存活率为37.6±3.3％。转RNAi干扰的转基因系3R-14、2R-31、2R-11和3R-20同野生型植株存活率之间也呈显著差异，平均存活率依次为10±10％，10±10％，20±0％和10±10％。同时比较了超量表达转基因系和野生型植株的电解质渗出率，发现电解质渗出率差异同实际抗寒存活率差异相符。通过调控脂肪酸去饱和酶基因的表达水平，一定程度上改变了杨树脂肪酸组成，从而改变了杨树的抗寒性。试验证明不饱和脂肪酸在生物抗寒过程中起重要作用，尤其是亚麻酸含量同植株抗寒性直接相关，通过提高植株体三烯酸含量的转基因途径应用于杨树抗寒育种改良是非常具有前景的，本研究为杨树的抗寒基因工程育种作了非常有意义的探索，为杨树等树木的抗寒基因工程育种打下了一定的理论和技术基础。