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研究背景在临床实践中,人们常发现骨折合并脑外伤患者骨折愈合速度明显加快,骨痂过度生长,甚至产生异位骨化(Heterotopic Ossification,HO);而许多感觉神经损伤的患者,骨折愈合速度往往较慢,发生骨不愈合、骨不连率较高。有研究表明,去除大鼠骨膜机械感受器会引起骨折不愈合,骨不连的局部几乎找不到正常神经元的分布,秦煜等[2]学者给胫骨骨折大鼠皮下注射脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF),结果发现愈合加速同时骨痂的体积也明显下降,提示神经系统在不同水平参与骨折修复和改建以及正常骨代谢的调控。随着神经系统对骨折愈合影响的深入研究,曹良国等学者研究发现鞘注神经生长因子(NGF)可以促进大鼠胫骨骨折愈合,初步证明中枢神经系统可能通过"NGF—DRG神经肽一骨”途径实现对成骨机制的调控,推测神经系统最终通过分布在骨组织的末梢神经释放神经生长因子、降钙素基因相关肽(CGRP)等神经肽信号,影响成骨细胞和破骨细胞来实现。Imai也通过电镜观察,认为干骺端的成骨细胞和破骨细胞、骨膜衬里细胞是骨组织CGRP免疫阳性神经纤维作用的靶细胞。其中成骨细胞(Osteoblast, OB)所分泌的两种细胞因子骨保护素和护骨素配体在骨代谢疾病发病机制中发挥重要的作用。骨保护素(OPG)是OB表达的可溶性肿瘤坏死因子受体超家族中的成员；护骨素配体,又称细胞核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa Bligand, RANKL)是一种Ⅱ型跨膜蛋白,是破骨细胞(Osteoclast, OC)分化所必需的细胞因子,具有诱导OC生成作用。OPG能特异性地与可溶性RANKL结合,从而抑制OC生成、分化和成熟,抑制骨破坏。因此,OPG和RANKL在OC分化、活化过程中占重要地位,参与了骨破坏和骨形成的基本过程。骨微环境中OPG/RANKL表达量的比值决定了骨代谢的方向。降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide, CGRP)是分布较为广泛的一种感觉神经源性神经肽,主要分布在代谢活跃的骨结构中,通过调节骨细胞发育、分化及活性,从而间接调节骨折愈合过程,其作用机制目前尚不清楚。这种作用可能与CGRP受体及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)信号通路的调控有关。MAPK是普遍存在于真核细胞中的一类高度保守丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)蛋白激酶,能将多种细胞外刺激产生的信号通过级联反应从细胞膜传递到细胞核内,在细胞增殖、分化、凋亡、应激、炎症以及免疫反应等多种生理和病理过程发挥着极其重要的作用。MAPK包括3个经典的亚家族途径,即细胞外调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK), c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinases, JNK)和P38MAPK。综上所述,降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide CGRP)作为重要的感觉神经信号分子,因其在骨折愈合调控中的重要作用而受到广泛关注。降钙素基因相关肽参与骨折愈合的调控是通过影响成骨细胞功能实现的,但CGRP调控骨折愈合的分子机制尤其是其作用于成骨细胞作用的胞内信号传导通路的认识尚不明确。目的：本研究通过体外培养人MG-63成骨肉瘤细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和细胞计数法观察对比不同浓度外源性CGRP及其受体拮抗剂CGRP8-37和细胞外信号调解激酶ERK特异性抑制剂PD98059对人MG-63成骨肉瘤细胞增殖影响。通过免疫细胞化学方法观察细胞OPG/RANKL、ERK表达强度的变化。研究CGRP对成骨细胞的作用,尝试验证降钙素基因相关肽通过ERK信号通路促进人成骨细胞增殖,以进一步探讨神经调控骨折愈合的分子机制,为临床骨创伤及骨营养代谢性疾病的治疗提供理论依据。方法1、MG-63成骨肉瘤细胞细胞来源：美国组织培养库(American Type Culture Collection),由南方医院创伤骨科实验室冻存。以含10%小牛血清的DMEM培养基在37℃,饱和湿度及5%CO2条件下培养,根据细胞生长情况每2～3天换液一次,每4-5天常规胰酶消化传代,倒置相差显微镜观察细胞形态。2、细胞依次经过解冻复苏、培养传代、冻存,取对数期细胞进行试验。3、第一部分实验分六组：A组：空白血清对照组(Contro)；B组：浓度10-10mmol/L CGRP低剂量组(low doses,LD)；C组：浓度10-9mol/L CGRP中剂量组(middle doses,MD)；D组：浓度10-8mol/L CGRP高剂量组(high doses,HD)；E组：浓度10-8mol/L高剂量CGRP+CGRP8-37组；F组：浓度10-8mol/L高剂量CGRP+PD98059组。主要比较不同浓度CGRP组和空白对照组经CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK阻断剂PD98059干预后与未经抑制剂干预后的细胞数量增殖的变化。第二部分共分五组：A组：对照组,不含CGRP和CGRP8-37的DMEM培养液；B组：含终浓度为10-8mol/L CGRP DMEM培养液；C组：实验组,含终浓度为10-8mol/L CGRP和含CGRP8-37的DMEM培养液；D组：实验组,含终浓度为10-8mol/L CGRP和含PD98059的DMEM培养液；E组：以PBS代替一抗作阴性对照,结果为阴性说明—抗特异性强。每组设2孔。主要观察经CGRP受体拮抗剂CGRP8-37.ERK阻断剂PD98059干预后与未经抑制剂干预的OPG/RANKL、ERK蛋白表达变化。4、各组应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)和细胞计数法观察干预剂干预后各时间段不同浓度CGRP及其阻滞剂和ERK阻断剂PD98059对MG-63细胞增殖功能的影响；其中MTT法按分组给予不同干预,分各时间点加入MTT继续培养4h,再加入二甲基亚砜,使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔吸光值,每组设六孔；5、MG-63细胞给予CGRP孵育5～60min,按分组不同给予CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK阻断剂PD98059预处理,24h后使用S-P法免疫细胞化学法观察OPG和RANKL、ERK蛋白表达情况。显微镜下观察免疫组化切片并拍照,每张选取4个不重复区域采用Image Pro4.5图像分析系统测定阳性产物的平均光密度(OD)值。6、统计分析：实验数据以均数士标准差(x±s)表示,SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,整体比较采用重复测量数据的方差分析；同一组别不同时间点的比较采用重复测量数据的方差分析；同一时间点不同组别的比较采用One-Way ANOVA进行分析,用LSD法对各组数据进行多重比较,若经Levene检验,数据不满足方差齐性,则采用方差分析的近似方法Dunnet’s T3法进行统计分析。P<0.05时有统计学意义。结果1. CGRP对MG-63细胞增殖的影响CGRP随时间推移呈浓度依赖性促进MG-63细胞增殖,各浓度组与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),其中以CGRP浓度为10-8mol/L时MG-63细胞增殖作用最强。2. CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK阻断剂PD98059对对MG-63细胞增殖的影响PD98059和CGRP8-37预处理后,CGRP诱导的MG-63细胞的增殖显著降低,细胞数量显著下降,与10-8mol/L CGRP组比较差异有统计学意义(P<0.05),但仍高于空白对照组。3. CGRP对MG-63细胞0PG和RANKL、ERK表达的影响CGRP可促进OPG、ERK表达,抑制RANKL表达,与正常对照组比较差异有统计学意(P<0.05)。4. CGRP受体拮抗剂CGRP8-37、ERK阻断剂PD98059对对MG-63细胞0PG和RANKL、ERK表达的影响CGRP8-37预处理后,CGRP诱导的MG-63细胞OPG、ERK蛋白表达均显著降低(P<0.05),但仍高于对照组,RANKL表达升高,但仍低于正常对照组(P<0.05)。PD98059预处理后CGRP诱导的MG-63细胞OPG、ERK蛋白的表达均显著降低(P<0.05),低于10-8mol/L CGRP孵育组,RANKL表达较10-8mol/L CGRP升高,有统计学意义(P<0.05)。结论1. CGRP在一定时间范围内呈浓度依赖性促进MG-63细胞增殖,CGRP阻断剂CGRP8-37和ERK通道阻断剂PD98059可以减弱这一效应；2. CGRP可以上调MG-63细胞OPG、ERK蛋白表达,下调RANKL蛋白表达；CGRP阻断剂CGRP8-37和ERK通道阻断剂PD98059可以减弱这一效应；3. CGRP能够通过ERK信号通路调节OPG/RANKL的比值达到对MG-63细胞的调控作用。