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肌醇又称环己六醇,具有多元羟基结构,广泛分布在植物、动物及微生物中,是多种细胞生命活动必需的物质,参与人体的新陈代谢,因此肌醇的高效生产对其在医药、食品、化妆品以及饲料等领域具有重要意义。目前肌醇的生产方法有水解法、酶法、化学合成法以及离子交换法等。其中水解法是肌醇最主要的生产方法,主要是以米糠、玉米糠等为原材料,从中提取。但是该法步骤繁琐,原料利用率低,对设备要求严格等,导致肌醇的成本一直居高不下。而酶法合成肌醇具有高效,环保和节约资源等优点,越来越受到广泛关注。因此,本研究构建了一套通过酶法高效廉价生产肌醇的方法。首先,在大肠杆菌中克隆表达了三种不同来源的多聚磷酸葡萄糖激酶(polyphosphste glucokinase,PPGK)、五种不同来源的磷酸-1-肌醇合成酶(inositol-1-phosphate synthase,IPS)和两种不同来源的肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase,IMP),通过酶表达条件优化以及高密度发酵等方法建立了大肠杆菌的高效表达系统,快速的获得相关酶。同时利用实验室已有的大肠杆菌高效表达平台的质粒筛选系统,筛选有利于蛋白表达的质粒,实现了多聚磷酸葡萄糖激酶,磷酸-1-肌醇合成酶和肌醇单磷酸酶的高效表达。然后,通过对酶的纯化以及酶活检测,得到活性最高的酶,并且对酶的性质进行检测,从而确立了肌醇的生产条件,即pH为7.0,温度为37℃,并对AspPPGK酶,TbIPS酶与EcIMP酶的用量进行了摸索,确定了酶的最佳反应用量及比例,即当葡萄糖底物浓度为100 m M时,AspPPGK的酶量在5-10 U/mL,TbIPS的酶量为60-75 U/mL,EcIMP酶的用量为100 U/mL。并在此优化条件下进行了肌醇的生产,提高了肌醇的转化率,缩短了生产时间。但是在最优条件下进行反应,却发现随着底物浓度的增加,肌醇的转化率降低。通过对两种底物(葡萄糖与聚磷酸钠)的抑制作用进行实验探究,发现葡萄糖对肌醇的生成没有影响,而聚磷酸钠由于具有特殊的结构,对磷酸-1-肌醇合成酶具有抑制作用,从而降低了肌醇的转化率。为了消除聚磷酸钠的抑制影响,本研究采用两步法合成肌醇,最终通过反应条件优化,实现了由葡萄糖到肌醇90%的转化率,从而建立了高效酶法转化生产肌醇的技术。因此,本研究通过三种酶的催化作用,优化了酶反应条件及酶用量,以葡萄糖为底物,高效的转化成肌醇,为酶法生产肌醇提供了新的思路及研究依据。