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前言肿瘤坏死因子样微弱诱导剂(TNF-like weak inducer of apoptosis,Tweak)是TNF配体家族成员之一,为Ⅱ型跨膜蛋白,主要与细胞表面的TNF受体家族成员—Fn14(fibroblast growth factor inducible14)结合形成信号复合物来发挥广泛的生物学活性,如:介导细胞凋亡、诱导细胞的分化、增殖、移行和粘附,还可诱导内皮细胞增殖和血管形成。而目前发现的7种肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumornecrosis factor receptor-associated factors,TRAFs)家族成员(TRAF1-7),作为一类重要的细胞衔接蛋白,能够与多种细胞表面受体的胞浆部分结合,参与多个细胞内信号转导通路的活化,包括NF-κB和JNK通路的活化。这7种成员尽管都含有TRAF同源结构域,但是在信号转导过程中所起到的作用却不尽相同,其中以TRAF2最为重要。目前,国内外研究认为,在细胞系中外源性转染TRAF2使之过表达可促进NF-κB活化。本实验主要利用免疫荧光检测几种不同乳腺癌细胞系中Fn14的表达情况,利用Western Blot和免疫共沉淀检测在rhTWEAK(重组人TWEAK)刺激下几种乳腺癌细胞系中TRAF2表达改变的情况,以及经过rhTWEAK刺激之后是否发生了NF-κB信号通路的活化。材料与方法一、材料正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s。二、主要试剂和来源羊抗人多克隆anti-Fn14抗体(sc-27141)、鼠抗人单克隆anti-TRAF1抗体(sc-6253)鼠抗人单克隆anti-TRAF2抗体(sc-7346)均购自美国Santa Cruz公司。鼠抗人单克隆anti-Phospho-IκBα抗体(#9246)购自Cell signaling公司。人重组TWEAK(rhTWEAK)(#310-06)购自Peprotech公司。DAB酶底物显色试剂盒(ZLI-9032)和辣根酶标记第二抗体(ZB-2301)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫共沉淀相关μColumns(Order No.130-042-701)和μMACS Protein GMicroBeads(Order No.130-071-101)购自德国Miltenyi Biotec公司。DMEM高糖、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自GIBCO公司。胰酶(Order No.27250018)购自美国Invitrogen公司。Western blot及IP细胞裂解液(Order No.P0013)购自碧云天生物技术研究所。三、方法1、应用免疫荧光方法检测Fn14在培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s中的表达。2、应用Western blot方法检测培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s经rhTWEAK刺激之后,TRAF2表达改变的情况。3、应用免疫共沉淀方法检测培养的正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s经rhTWEAK刺激之后,与TRAF1结合状态的TRAF2表达改变的情况。4、应用Western blot方法检测培养的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s经rhTWEAK刺激之后NF-κB信号通路的活化情况。5、应用SPSS12.0统计分析软件,对TRAF2在各细胞系中的表达量以及TRAF2与TRAF1在各细胞系中的结合量进行方差分析及其两两t检验,p＜0.05为有统计学意义,p＜0.01为有显著统计学意义。结果1、免疫荧光方法检测Fn14在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌细胞系中的表达。(1)Fn14在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中阳性表达。(2)Fn14在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-435s中不表达。2、Western blot方法检测经rhTWEAK刺激之后TRAF2在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌不同转移性细胞系中的表达。(1)以不同浓度的rhTWEAK与三株细胞系分别孵育24h后收集细胞,经Western blot结果显示,Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中TRAF2呈浓度依赖性表达上调(P＜0.01),而Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF2则也呈浓度依赖性表达上调(P＜0.01)。(2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株细胞系分别孵育,按照设计的时间点收集细胞,经Western blot结果显示,Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中TRAF2呈时间依赖性表达上调(P＜0.01),而Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中TRAF2也则呈时间依赖性表达上调(P＜0.01)。3、免疫共沉淀检测经rhTWEAK刺激之后TRAF2和TRAF1在正常乳腺上皮细胞系及乳腺癌不同转移性细胞系中的结合情况。(1)TRAF2与TRAF1在MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-435s三种细胞系中均结合。(2)以100ng/ml的rhTWEAK同三株细胞系分别孵育24h后收集细胞,与TRAF1结合的TRAF2在Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中表达明显上调(P＜0.01),而在Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中表达下调(P＜0.05)。4、Western blot方法检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s经rhTWEAK刺激之后NF-κB信号通路的活化情况。(1)在MDA-MB-231中,经rhTWEAK刺激之后发生了短暂(15-30min)的I-κBα的磷酸化。(2)在MDA-MB-435s中则没有发生一过性的I-κBα的磷酸化。结论1、Fn14在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中阳性表达,在正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系MDA-MB-435s中不表达。2、rhTWEAK对TRAF2的诱导作用表现为在Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中呈浓度和时间依赖性上调,而在Fn14阴性表达的细胞系MCF-10A和MDA-MB-435s中也呈浓度和时间依赖性上调。3、rhTWEAK可以诱导Fn14阳性表达的细胞系MDA-MB-231中NF-κB信号通路的活化。提示在乳腺癌细胞系中,rhTWEAK对TRAF2的诱导作用可能是由Fn14和TWEAKR2同时介导的,且TRAF2对于TRAF1发挥生物学效应是起到桥梁作用,这种方式在rhTWEAK诱导的NF-κB的活化中具有重要作用。