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糖基化修饰是一种重要的蛋白翻译后修饰,糖基化的改变与众多疾病的发生、发展相关,目前临床上应用的肿瘤标志物大多为糖链或糖蛋白。由于糖肽仅占蛋白酶解肽段很小一部分且糖链结构异常复杂,因此,对复杂生物体系蛋白质的糖基化的分析面临着巨大挑战。目前研究N-糖基化的方法已经相当成熟,而研究O-糖基化的方法存在特异性不高或不能有效鉴定糖基化位点的问题。因此亟待开发或者优化一条高特异性富集、鉴定O-糖肽/蛋白的策略。 本文第一部分的研究介绍了一条应用末端炔基修饰磁珠富集 P19小鼠畸胎瘤细胞神经分化过程中分泌的O-GalNAc糖基化蛋白的策略。结果显示,我们鉴定得到的蛋白数据库中至少包含50个未报导的O-GalNAc糖蛋白,而且在鉴定的O-GalNAc糖基化蛋白中至少有40个与神经细胞的特异性生物学过程相关,如轴突生成、神经发育等。结果表明该策略下,磁珠对复杂体系中O-糖基化蛋白有一定的富集作用。然而,我们也看到富集的蛋白数据库中有大量的胞内蛋白,表明磁珠的特异性有待提高。为此,我们对磁珠表面疏水性结构进行了亲水性改造,结果显示结构改造后磁珠富集能力至少提高40%、灵敏度至少提高10倍,这为后续复杂样品中各类糖蛋白或者糖肽的富集及糖基化位点的鉴定提供了新的工具。 第二部分研究是基于目前大量研究表明唾液酸与肿瘤细胞的转移密切相关。为此,我们以四株遗传背景相同但转移能力存在差异的肝癌细胞系(MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3和 HCCLM6)为研究对象,探讨肝癌细胞(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的转移与唾液酸糖基化修饰的关系。首先,我们验证了四株细胞转移潜能依次为97L<97H< LM3< LM6;其次,应用凝集素检测四株细胞表面α-2,6-唾液酸表达水平依次为97L>97H>LM3>LM6,暗示四株细胞转移潜能与其α-2,6-唾液酸修饰呈现负相关关系。接下来,为进一步探究可能参与负调控HCC转移的唾液酸糖基化蛋白,我们利用糖组学的方法对四株细胞膜表面唾液酸糖基化蛋白进行富集与鉴定,并筛选出四株细胞中表达量存在差异的唾液酸膜受体蛋白。经生物信息学分析,发现至少有70个膜蛋白的表达量在高低转移潜能不同的肝癌细胞中存在明显差异。结果暗示在四株细胞中表达量存在差异的唾液酸化的膜受体蛋白如整合素β1,Dipeptidyl peptidase4具有负调控HCC转移的可能性。本研究为进一步揭示α-2,6-唾液酸修饰是如何调控膜受体蛋白功能从而负调控HCC转移的分子机制打下了坚实的基础。