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目的:核不均一核糖核蛋白A2/B1 (hnRNPA2/B1)是一种RNA结合蛋白, hnRNP家族中最重要成员,hnRNP A2/B1参与mRNA的转运和mRNA的代谢(包括mRNA翻译和其稳定性的调节、以及mRNA的定位)。hnRNP A2/B1过表达与生长调节紊乱存在密切关系,目前许多研究显示肺癌细胞hnRNPA2 /B1蛋白存在过表达,并且早期肺癌和癌前病变已出现,揭示它有可能是肺癌早期的标志物。本实验我们原核诱导表达hnRNP A2/B1蛋白,以其纯化蛋白制备兔抗人多克隆抗体,为进一步的研究提供基础。方法:1.用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,从pGEX4T1-hnRNP A2/B1质粒上切下hnRNP A2/B1基因片段,然后将该片段连接到经过同样双酶切的原核表达载体pET28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a(+)-hnRNPA2/B1,以酶切和测序鉴定。2.将pET28a(+)-hnRNPA2/B1重组质粒转化入大肠杆菌BL21振荡培养,用IPTG诱导表达融合蛋白并且优化条件,以SDS-PAGE分析融合蛋白的存在及可溶性. 3.以最佳的诱导,扩大培养并离心收集细菌,超声破碎后以亲和层析柱纯化蛋白。4.将纯化的融合蛋白作为抗原,在与佐剂乳化后,背部皮下免疫家兔共4次,后收集家兔的血清,用硫酸铵沉淀法初纯抗体。以酶联免疫测定法、Western-blot及免疫组织化学染色方法鉴定多克隆抗体的效价和特异性。结果:1.重组质粒经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,进行琼脂糖凝胶电泳后,观察到分子量约5.4kb和1.1kb的条带,与预期相符,并测序正确,成功构建了重组原核表达载体pET28a(+)-hnRNPA2/B1。2.带有pET28a(+)-hnRNPA2/B1大肠杆菌诱导表达后收获菌体,经SDS-PAGE电泳分析,在相对分子质量约在41KD可见明显的条带,与预计相符,而未经诱导菌与空载体对照菌则无条带。并且融合蛋白以可溶蛋白和包涵体两种形式存在。诱导表达最佳的诱导条件为37℃,4h,IPTG浓度为0.1mmol/L。3.以亲和层析纯化细菌破碎后上清中的可溶蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,蛋白较纯。4.将纯化的融合蛋白免疫家兔后,成功获得了兔抗人hnRNP A2/B1多克隆抗体。酶联免疫测定法测定抗体效价为1:8000,Western-blot分析和免疫组织化学得出制备的抗体可与hnRNP A2/B1蛋白发生特异性反应。结论:获得纯化的hnRNPA2/B1蛋白并制备了高效价和特异的兔抗人hnRNP A2/B1多克隆抗体,为深入研究hnRNPA2/B1生物学功能及与肺癌的关系提供了实验素材。