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Fas受体/配体（Fas/FasL）系统在肝细胞凋亡中起重要作用。当FasL与Fas结合后,会通过Fas相关死亡结构域（Fas-associated death domain,FADD）传递细胞凋亡信号,募集procaspase-8形成死亡诱导信号复合物（death-inducing signaling complex,DISC）,随后激活下游的caspases,从而诱发肝细胞凋亡。表面抗原（HBsAg）是慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者肝脏和外周血中最为丰富的HBV编码蛋白,且HBsAg在Fas调控肝细胞凋亡中的作用目前并未被阐释,因此本文旨在研究HBsAg对Fas介导肝细胞凋亡的影响及机制。本研究第一部分旨在探讨HBsAg对Fas介导肝细胞凋亡的影响。首先我们建立了HepG2-pHBsAg和HepG2-pcDNA3.1混合克隆细胞株并验证表达。通过CCK-8、TUNEL以及AnnexinV实验发现HBsAg增加HepG2细胞对人Fas单克隆抗体anti-Fas CH11诱导细胞凋亡的敏感性,此外HBsAg促进anti-Fas CH11和FasL诱导的人原代肝细胞凋亡。以上结果表明:HBsAg可促进Fas介导的肝细胞凋亡。本研究第二部分旨在探讨HBsAg促进Fas介导肝细胞凋亡的机制。本部分第一章研究HBsAg对p53、mFas、sFas、FasL的表达以及Fas棕榈酰化修饰的影响。为此采用realtime RT-PCR、半定量RT-PCR和western blot检测HepG2-pHBsAg和HepG2-pcDNA3.1细胞株中p53、mFas、sFas以及FasL的mRNA和蛋白水平的差异。并通过酰基-生物素交换法（acyl-biotin exchange,ABE）对HBsAg是否影响Fas的棕榈酰化修饰进行检测。结果发现HBsAg对p53、mFas、sFas、FasL的表达以及Fas棕榈酰化修饰均无影响。本部分第二章研究HBsAg对DISC的影响。为此,采用western blot检测HBsAg对Fas的聚合、FADD、FLIPL/S以及procaspase-8蛋白水平的影响,采用免疫沉淀（Immunoprecipitation,IP）检测HBsAg对DISC各组分募集的影响,采用caspase活性实验检测caspase 8,9,3/7的活性。结果发现在anti-Fas CH11处理下,HepG2-pHBsAg细胞中Fas的聚合,procaspase-8的活化高于对照组,FLIPL/S蛋白水平低于对照组,但FADD的蛋白水平与对照组相比无变化。进一步以Fas抗体进行免疫沉淀,结果发现HepG2-pHBsAg细胞中Fas聚合体和FADD、procaspase-8的募集高于对照组,FLIPL/S的募集低于对照组。并且HepG2-pHBsAg细胞中caspase8,9,3/7活性高于对照组。以上结果表明:HBsAg通过促进Fas聚合体的形成,减少DISC上FLIPL/S的募集,从而促进了procaspase-8的活化。本部分第三章研究AKT磷酸化在HBsAg促进Fas介导的肝细胞凋亡中的作用。为此,我们引入AKT特异性激动剂SC79以及过表达AKT,采用AnnexinV检测HBsAg对AKT激活引起的Fas介导凋亡减少的影响,采用western blot检测HBsAg对AKT活化负调控DISC各组分的影响。结果发现,在anti-Fas CH11作用下,SC79处理及AKT过表达后,细胞的凋亡率降低,但表达HBsAg的HepG2-pHBsAg细胞凋亡率仍高于HepG2-pcDNA3.1细胞。AKT活化后,Fas受体的聚合水平和procaspase-8的切割水平均降低,FLIPL/S蛋白水平升高,但表达HBsAg的HepG2-pHBsAg细胞,Fas受体的聚合水平和procaspase-8的切割水平仍高于HepG2-pcDNA3.1细胞,而FLIPL/S的表达水平低于HepG2-pcDNA3.1细胞。以上结果表明,HBsAg可通过恢复AKT激活所致的Fas受体聚合的减少和procaspase-8切割的减弱,以及FLIPL/S表达的增加,从而逆转由AKT激活所引起的Fas介导肝细胞凋亡的减少。说明,HBsAg促进Fas介导的肝细胞凋亡是AKT依赖性的。本部分第四章研究HBsAg下调AKT磷酸化水平的机制。为此,我们采用western blot检测HepG2-pHBsAg和HepG2-pcDNA3.1细胞株中AKT上游PDPK1、pPDPK1（Ser241）、mTOR、pmTOR（Ser2481）以及PTEN蛋白水平的差异。发现HepG2-pHBsAg中pAKT（Thr308）、pAKT（Ser473）以及上游调控因子pPDPK1（Ser241）、pmTOR（Ser2481）水平均低于对照组。内质网压力减轻剂4-PBA可以使HepG2-pHBsAg细胞中pAKT（Thr308）、pAKT（Ser473）、pPDPK1（Ser241）和pmTOR（Ser2481）蛋白水平升高。AnnexinV结果显示,HBsAg促进anti-Fas CH11介导的肝细胞凋亡可以被4-PBA部分缓解。IP结果显示HBsAg不与AKT、PDPK1、mTOR以及PTEN发生相互作用。以上结果表明HBsAg通过诱导内质网压力（endoplasmic reticulum stress,ER stress）使PDPK1和mTORC2失活进而抑制AKT的磷酸化。本部分第五章研究HBsAg突变对Fas介导的肝细胞凋亡的影响。为此,我们选择14种常见的HBsAg突变体,建立混合克隆细胞株并验证表达。从中筛选得到5个胞外分泌降低,胞内滞留明显的HBsAg突变细胞株（L49T,M133I,G145R,S204R和M213I）。采用western blot对其GRP94、p-eIF2α、eIF2α以及AKT、pAKT（Thr308）、pAKT（Ser473）蛋白水平进行检测。采用半定量RT-PCR对其剪接型XBP1（S）mRNA水平进行检测,采用AnnexinV及western blot对其在Fas介导下的细胞凋亡及active caspase-8,tBID、Cytochrome C（胞质/胞膜）、active caspase-3的蛋白水平进行检测,结果发现,HepG2-pHBsAg突变体中GRP94、p-eIF2α的蛋白水平和XBP1（S）mRNA水平均高于HepG2-pHBsAg,而pAKT（Thr308）、pAKT（Ser473）蛋白水平低于HepG2-pHBsAg。HepG2-pHBsAg突变体凋亡率以及active caspase-8、tBID、Cytochrome C（胞质）、active caspase-3蛋白水平高于HepG2-pHBsAg,BID和Cytochrome C（胞膜）蛋白水平低于HepG2-pHBsAg。以上结果表明,L49T,M133I,G145R,S204R和M213I突变导致HBsAg胞内滞留增多,增强内质网压力,进一步促进Fas介导的肝细胞凋亡。本研究第三部分旨在探讨HBsAg对Fas介导的小鼠肝脏功能的影响。为此,通过AAV8尾静脉注射,实现小鼠肝脏HBsAg（包括G145R和S204R突变）表达,通过anti-Fas Jo2腹腔注射建立小鼠急性肝衰竭（ALF）模型。对肝组织以及血清检测发现,和AAV8-HBsAg小鼠相比,AAV8-G145R和AAV8-S204R小鼠血清HBsAg量显著降低,而肝内滞留明显。AAV8-HBsAg小鼠肝组织AKT磷酸化水平低于AAV8-control,AAV8-G145R和AAV8-S204R小鼠AKT磷酸化水平更低。AAV8-HBsAg小鼠肝组织GRP94、p-eIF2α蛋白水平高于AAV8-control,AAV8-G145R和AAV8-S204R小鼠GRP94、p-eIF2α蛋白水平更高。在anti-Fas Jo2处理下,AAV8-HBsAg小鼠ALF存活率及生存时间低于AAV8-control,AAV8-G145R和AAV8-S204R小鼠存活率及生存时间更低,SC79预处理能够缓解anti-Fas Jo2诱导的小鼠ALF。此外,本部分研究结果还显示,在anti-Fas Jo2处理下,AAV8-HBsAg小鼠血清ALT/AST、肝细胞凋亡率以及caspase 8,9,3/7活性均高于AAV8-control,AAV8-G145R和AAV8-S204R小鼠则更高,SC79预处理减轻肝细胞凋亡和肝脏损伤。以上结果表明,HBsAg可促进小鼠肝脏组织细胞内质网压力,抑制AKT磷酸化,引发严重的肝细胞凋亡和肝脏损伤,并使小鼠ALF死亡时间提前及死亡率增加,而HBsAg G145R和S204R突变可以增强这种作用。研究还提示AKT激动剂SC79预处理能够缓解anti-Fas Jo2诱导的小鼠ALF,意味着AKT激动剂可保护Fas介导的ALF,强烈提示使用该类药物在临床上可提高ALF患者生存率。