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第一部分 肝细胞肝癌中HIF-1、VEGF的相关表达研究 目的：缺氧诱导因子—1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)是广泛存在于哺乳动物体内的一种转录因子，缺氧状态下可以调节多种靶基因如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等的表达。在肿瘤的缺氧反应过程中转录因子HIF-1起着中枢纽带的作用。HIF—1是一种由α、β亚基组成的异二聚体，HIF-1α是HIF-1的特异性活性调节亚基，缺氧刺激下HIF-1α的表达水平增加，与HIF-1β亚基形成稳定的二聚体，在共活化因子(如CBP、P300等)协助下，结合至靶基因的缺氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)，上调靶基因的表达。HIF-1α亚基的氨基酸401-603区域为氧依赖性降解区(oxygen-dependent degradation domain，ODD)。常氧状态下，HIF-1α蛋白通过ODD区域在VHL蛋白介导下被泛素化，被蛋白酶迅速降解(半衰期＜5分钟)。随着氧浓度的降低，HIF-1α蛋白降解过程被抑制，蛋白水平呈指数增长。VEGF是HIF-1的重要靶基因之一。缺氧时VEGF的转录和mRNA的稳定性均有增加。HIF-1通过与VEGF基因缺氧反应元件(5’-TACGTGGC-3’)结合，上调其转录。并且缺氧下RNA结合蛋白与VEGF的mRNA 3’端富含A、U的序列结合，阻断mRNA降解。研究肝细胞肝癌缺氧反应下，HIF-1和VEGF的相关表达变化，旨在探讨其在肝细胞肝癌发生、发展中的作用，及其相互调控机制。方法1.取PGZ细胞分别在缺氧条件下(37℃，5%C02，l%02)培养3h、6h、12h、 24h、48h。2.盯一PcR检测HIF一1。和vEGF的mRNA在肝细胞肝癌HePG:细胞中的表达 水平。3，饥嗽ern一blot检测HIF一1。和vEGF的蛋白在肝细胞肝癌HepGZ细胞中的表达 水平。结泉1.半定量RT一PCR法结果显示HIF一IQ的mRNA在不同缺氧培养时间下都有不同理度的表达，各组比较没有差异(P>0.05)。vEGF的mRNA随着缺氧时间的延长，明显增强(p<0.05)，与缺氧时间正相关。2.辘吕tem.blot法结果显示HeP众细胞缺氧培养不同时间HIF一1“和vEGF均随着缺氧时间延长，蛋白水平提高，并且与缺氧时间正相关。HIF一1。蛋白在对照组(常氧条件培养)细胞中几乎没有表达。结抢 H环一IQ和VEGF在肝细胞肝癌的缺氧反应中占据重要地位，缺氧状态下H净私1以蛋白含量提高，形成活性HIF一1，上调靶荃因VEGF的表达，参与肿瘤的取管生成和发生发展过程。 第二部分 EGcG对肝细血肝启伪均盆娜侧作用和对映暇反应的影响目的:绿茶含有多种茶多酚，其中含量最高的成分是:表没食子儿茶素没食子酸醚e禅rigailocatechin一3一gailate，E GcG)。EGcG主要有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒、抗突变和抗肿瘤形成等生物学活性和药理效应。研究发现EGCG可诱导多种肿瘤细胞包括肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞等的凋亡;可以通过阻滞肿痛细胞的生长周期而抑制其生长;并且可以抑制蛋白酪氮酸橄酶的活性，从而使某些酪氨酸蛋白不能磷酸化，抑制细胞生长。尿激酶是肿瘤生长的关键酶，肿乡薛搜袭转移需要尿激酶等蛋白水解酶的参与，EGCG可与尿激酶结合，干扰尿渊酶与底物结合，从而抑制酶活性。EGCG还可以通过调节体内一些与癌变有关的醉如鸟氨酸脱梭酶(ODC)、超氧化物岐化酶(s OD)等的活性达到抑制癌墓因的表达:抑制某些化学致癌物如亚硝酸盐、二甲阱、黄曲霉素等强烈的化学致密物对癌症的诱发作用;提高机体的免疫功能，刺激人外周血单核细胞产生lL一1和TNF，从而发挥抗癌作用。本课题的研究目的就在于研究EGCG是否可以捕制肝细胞肝癌的增殖，以及探讨EGCG对肿瘤细胞缺氧反应的作用及作用机栩。方雄1.采用倒置显微镜进行细胞形态观察并拍照记录2.细胞计数计算EGCG处理后肝瘤细胞HePq细胞悬浮/贴壁比值3.采用MTT法检测EGCG处理后肝癌细胞H哪心2细鲍的增殖情况4.缺载和EGCG双因素共同处理HePGZ细胞，RT一PCR和研阳滋em七lot检测 卜nF一1。和VEGF的mRNA及蛋白表达变化5.建立裸鼠肝癌种植模型，BGCG试验性治疗后，观察种植翻生长情况，RT.PCR 和W吮粗m七let检侧组织中HIF·IQ和VEGF的mRNA及蛋白表达变化始象1.EGcG对H印仇细胞有增殖抑制作用，呈荆t和时间依赖性2.HepGZ细胞在不同浓度EGCG作用下，缺氧培养12h，HIF一IQ的mRNA水平没有明显变化，但蛋白水平随着EGCG浓度提高降低;而vEGF的转录和蛋白表达均随着EGCG浓度提高，受到明显抑制，呈剂量依赖性。3.在IOOu以mLEGCG作用下，HePGZ细胞随缺氧时间的延长，HIF一1。的mRNA水平仍然没有明显变化，蛋白水平不断降低;VEGF的mRNA和蛋白表达水平均受到明显抑制，呈时间依赖性。4.荷瘤裸鼠接受EGCG腹腔内注射的试验性的治疗结果显示，EGCG高剂量组肿瘤的体积和重量均明显低于对照组和低剂量组(p<0.01)，低剂量组的肿瘤体积和重量于对照组之间存在差异(p<0.05)。5.裸鼠移植瘤标本的RT一PCR结果显示，EGCG不能影响HIF一IQ的转录，但可以明显抑制其蛋白水平。VEGF的基因转录和蛋白表达明显受抑制，呈剂量?