目的:Rh血型系统是最复杂的红细胞血型系统,在临床输血中的重要性仅次于ABO血型系统。目前已经确定的Rh系统抗原多达40多个。位于人类染色体1p34.3-36.1的RHD基因和RHCE基因分别编码Rh血型系统的抗原Rh D和Rh C/c、Rh E/e,其中D抗原在输血医学和产科学中的意义最为显著。一般称D抗原阴性的为Rh阴性血型,D抗原阳性的为Rh阳性血型。弱D表型是指D抗原表位都存在,抗原表位无质量变化,仅仅是抗原表位数量减少,这种只是由于数量变化而导致的弱反应性D抗原,统称为弱D。有关弱D表型的分布与基因分型研究结果各地并不一致,且大部分报道集中在中国台湾人群,国内只有南方地区弱D表型的分布与基因分型研究。对于河北地区人群中Rh弱D的分布及其分子背景的研究尚不全面,因此本研究对河北人群弱D表型做了血清学鉴定,并用序列分析方法对其分子机理进行了研究。Rh血型系统中最重要的抗原有5种,分别是:C、c、D、E、e抗原。其中以D抗原的免疫原性最为强烈。D抗原表达弱的红细胞可能刺激D阴性受血者产生抗体,临床上确实见到过受血者被弱D抗原致敏,发生溶血性反应的病例,这已经引起临床医护工作者与科研人员的重视。<<美国输血协会血库和输血机构标准>>要求对献血者的标本检验是否是弱D表型,对受血者血清中已有抗-D时,切不可输用弱D型红细胞,因该受血者血清抗-D会极快地破坏输入的弱D型红细胞,因此,揭示弱D表型的遗传背景及基因多态性,设计相应的PCR试验准确而高效地检测弱D表型,是提高临床输血安全性的重要手段。本研究将对河北地区随机抽取的Rh阴性献血者血样进行血清学筛选,分析筛选出的弱D表型的分子遗传学背景。实验均在河北省血液中心配型实验室进行,通过本项目中的血清学筛选,我们可以了解河北地区Rh阴性献血者中弱D的分布比例,通过分子背景的研究,我们能够发现弱D的遗传多态性,希望能发现新的等位基因则更有意义。通过该项目的研究,将弱D的基因检测作为今后河北地区弱D表型基因分型的鉴定方法,以便于将来根据弱D抗原的分子基础,更合理有效安全的使用弱D血液。方法:1用标准血型血清学方法对78000名河北省血液中心的献血者进行Rh D抗原鉴定,对初筛为Rh阴性结果的,再用三种不同来源的抗D血清以抗人球蛋白方法进行Rh D抗原确定。2制备基因组DNA及Rh表现型采用微柱法从214例Rh阴性献血者全血中提取高纯度基因组DNA。并对其进行DNA浓度以及纯度的检测。3序列特异性引物PCR(sequence specific primers,PCR-SSP),以HGH(human growth hormone,HGH)为内对照,对RHD基因第3、4、5、6、7、9特异性外显子进行等位基因特异性PCR扩增。将PCR产物行2.5%琼脂糖凝胶电泳后,根据PCR产物的有无以及片段的长短,判定是否存在RHD基因表位的缺失。4基因检测采用天津市秀鹏生物技术开发有限公司研制的《人类红细胞RHD血型弱D、部分D基因检测试剂盒》对表位缺失样本进行分析。结果:1血型血清学实验在78000名河北省血液中心的献血者样本中经血型血清学方法鉴定Rh阴性的人为214例,占正常人群的比例为0.275%,35人为Rh弱D型,占正常人群的比例为0.045%。2对214例Rh阴性个体做血型血清学分型,全小因子ccee表型为88例,Ccee表型67例,cc Ee表型24例,Cc Ee表型15例,CCee表型12例,cc EE表型8例。3 PCR-SSP扩增结果显示河北汉族群体Rh D阴性基因外显子存在着明显的多态性。在35例弱D样本中,30例Rh D基因外显子完整,5例样本Rh D基因外显子部分缺失。4在30例Rh D基因外显子完整的样本中检出27例弱D15型、3例弱D24型;5例部分D缺失中,检出3例为RHD基因2-9外显子融合,表示为RHD-CE(2-9)-D;1例样本检测为D Cat.Va type2;1例样本为D Cat.VI type2。结论:1在河北地区78000献血员人群中,常规血型血清学鉴定的Rh D阴性者为214例,占正常人群的比例为0.275%,其中检出35例弱D型,占正常人群的比例为0.045%。2 214例Rh阴性样本的Rh表现型全小因子ccee表型88例,Ccee表型67例,cc Ee表型24例,Cc Ee表型15例,CCee表型12例,cc EE表型8例。3 35例弱D型中检出30例Rh D基因外显子完整,其中27例弱D15型、3例弱D24型;5例样本Rh D基因外显子部分缺失,其中3例为RHD基因2-9外显子融合,表示为RHD-CE(2-9)-D;1例样本检测为D Cat.Va type2;1例样本为D Cat.VI type2。4在河北地区,常规鉴定的Rh D阴性的弱D型检出率为16.4%,其中主要是弱D15型,其占弱D型的77.1%。