鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是自然界中广泛存在的一种革兰氏阴性菌,属于一种机会致病菌,极易感染免疫功能低下的人,同时也是医院感染中最典型的临床病原菌之一。因其增殖速度快,粘附力极强,因此在医院环境中广泛分布,并且随着抗生素的大量使用,出现了越来越多的耐药菌株,鲍曼不动杆菌已经对全球医疗卫生系统构成了严重威胁。目前,临床上主要利用抗生素对抗鲍曼不动杆菌的感染,然而多重耐药菌株的出现,使得医生在治疗时不得不联合用药。可是联合用药存在许多弊端,因此相关疫苗的研制,对于预防鲍曼不动杆菌的疫情刻不容缓。可惜的是,目前还没有一种针对鲍曼不动杆菌的疫苗上市。细菌的胞外多糖是外膜结构的重要组成部分,其中的O-抗原多糖(O-polysaccharide,O-PS)具有一定的免疫原性,能够刺激机体产生保护性抗体,但是单独的多糖都是属于T-细胞非依赖性抗原,不能诱导体液免疫,产生的抗体主要是低亲和力的IgM;而通过在多糖上结合某个蛋白形成的多糖结合物作为疫苗能够诱导更好的免疫应答反应。多糖结合物能够与B-细胞结合并被降解,形成的糖肽能够递呈到主要组织相容性复合物MHC-Ⅱ,并将多糖展示给T-细胞,这样就能激活典型的T-细胞依赖性抗体的产生,诱导产生多糖特异性的IgG,记忆细胞也会大量增殖。因此本研究利用糖蛋白结合物作为免疫原的优势,基于鲍曼不动杆菌本身的多糖合成基因簇,将合成的多糖转移至目标底物蛋白上,在病原菌中一步法生物合成糖蛋白疫苗。首先,将实验室已经构建好的蛋白糖基化载体pET28a-PglL-CTB4573C转入鲍曼不动杆菌17978中,成功构建了糖基工程鲍曼不动杆菌。糖基工程鲍曼不动杆菌能够表达糖基转移酶PglL及底物蛋白CTB。PglL为脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)的糖基转移酶,对糖链和底物蛋白的要求较为宽松;CTB是霍乱毒素(CT)B亚单位,能够形成同源五聚体,当CTB作为载体蛋白时,会使融合表位抗原的免疫原性大大增强,刺激机体产生强烈的免疫反应。在成功构建糖基工程鲍曼不动杆菌后,通过诱导表达,获得了以鲍曼不动杆菌17978特异性多糖为目标抗原,以CTB为底物蛋白的特异性糖蛋白复合物;并利用底物蛋白自身的性质及携带的His标签,进行亲和层析和阳离子交换层析,得到了较纯的目的蛋白,之后对纯化的糖蛋白进行免疫原性评价。选取小鼠为模式动物,按照糖定量的结果,2.5μg/只进行免疫。本研究采用了腹腔和皮下两种免疫方式,用间接ELISA法检测小鼠血清抗体的滴度。无论是腹腔组还是皮下组,糖蛋白都能够刺激小鼠产生了 IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体,表明糖蛋白能够诱导机体产生体液免疫应答。最后对小鼠以2×LD50的攻毒剂量进行腹腔攻毒实验,攻毒后连续观察7天。结果显示:腹腔组的保护性达到100%,但皮下组没有显著的保护性。在蛋白纯化过程中,我们发现糖蛋白表达量较低,这对后期实验及药品的生产带来困难,因此根据鲍曼不动杆菌胞外多糖的合成途径,利用同源双交换法敲除了鲍曼不动杆菌本身的糖基转移酶PglLAb基因,以减少其本身的糖基转移酶与外源的PglL的竞争性,从而达到提高糖蛋白的产量。本研究构建了糖基工程鲍曼不动杆菌,并将其生产的糖蛋白纯化,经过动物实验证明了糖蛋白结合“疫苗”具有较好的免疫原性,这给后续深入研究带来必要性。在此基础上,敲除了鲍曼不动杆菌本身的糖基转移酶PglLAb基因,以期达到提高糖蛋白的产量,为后续的应用和疫苗的生产打下了基础。