【摘 要】
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该论文的主要工作包括寻找Pc17-Pho85作用底物,底物的磷酸化,以及Pc17-Pho85对底物磷酸化的功能意义.利用酵母双杂交（two-hybrid）系统,以Pc17为靶分子寻找其作用底物,从酵母cDN
【出 处】
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中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国科学院上海生命科学研究院
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该论文的主要工作包括寻找Pc17-Pho85作用底物,底物的磷酸化,以及Pc17-Pho85对底物磷酸化的功能意义.利用酵母双杂交（two-hybrid）系统,以Pc17为靶分子寻找其作用底物,从酵母cDNA文库中克隆到一个与Pc17结合的蛋白质,Ylr190w;根据同源性分析以及公布的数据,发现另一个Pc17结合蛋白质,Yjl048c.Pc17与Ylr190w/Yjl1084c之间的相互作用在体内通过双杂交分析或免疫共沉淀得到证实,在体外通过GST沉降的方法也被确证.Ylr190w全长491个氨基酸,在大肠杆菌中表达并纯化了GST-Ylr190w,它可以被Pc17-Pho85磷酸化;Yjl084c全长1046个氨基酸,体外翻译获得的全长蛋白也可以被Pc17-Pho85磷酸化;分别表达纯化Yjl084c各个片段的GST融合蛋白质,其中间部分可以被磷酸化.它们的磷酸化均受到无机磷浓度影响：高磷条件时磷酸化程度高,低磷条件时磷酸化程度低.此外,还发现Pho81与Pc16,Pc17,以及Pho80之间都存在不同程度的相互作用.构建Ylr190w的两个突变体,Ylr190w（Tl2A）和Ylr190w（S/T-A）,其中当12位Thr突变成Ala后（Tl2A),仍然可以被磷化;而突变所有7个Ser/Thr-Pro模式的Ser/Thr后,不再被磷酸化.这表明Pc17-Pho85磷酸化保守位点为Ser/Thr-Pro模式的Ser/Thr.利用同源重组分别构建ylr190w和jyl084c缺失株,分析各缺失株的表型：缺失YLR190w后,细胞生长变慢,复制时间变长,G<,2>-M期比例减少,而G0-G1和S期都增加;缺失YJL084c后,未观察的明显变化.
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