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慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是一种起源于白血病干细胞(Leukemia Stem Cell,LSC)并严重威胁人类健康的恶性增殖性疾病。Ph染色体是CML的重要标志,它源于第9号染色体和22号染色体相互易位,使第9号染色体上大部分的c-abl原癌基因易位到22号染色体的BCR基因上而形成一个融合的BCR/ABL融合基因。该基因编码的蛋白质P210bcr/abl具有异常活跃的酪氨酸激酶活性,是导致CML发生的主要机制。格列卫(IM)是以bcr/abl融合蛋白为靶点的酪氨酸激酶抑制剂,能是大部分的CML患者得到有效的缓解。然而,由于LSC不依赖BCR-ABL的蛋白激酶活性存活,导致格列卫不能彻底清除LSC而无法治愈CML,患者必须长期服药以控制病情。格列卫价格昂贵,终生用药给患者造成沉重的经济负担。而且,长期用药将导致更多的副作用和耐药的发生。因此,迫切需要探寻有效靶向清除CML LSC的方法,以期根治CML。鬼臼毒素是我国传统中药鬼臼的活性成分,但由于其是通过抑制微管蛋白发挥作用,故毒性大,限制了临床的直接应用。鬼臼苦素(picropodophyllin,PPP)是鬼臼毒素的异构体,具有順式内酯环,对微管蛋白没有抑制作用,故不具有细胞毒性。许多研究结果显示,鬼臼苦素也具有广泛的抗肿瘤效应,但是对正常细胞基本上没有毒性。这表明鬼臼苦素对肿瘤细胞有一定的特异性。目前,有报道发现鬼臼苦素能有效诱导CML原代细胞和细胞系发生细胞凋亡,以及抑制细胞系的克隆形成,但是鬼臼苦素对CML LSC的研究尚无报道,值得深入研究。为此,本研究分为三部分进行阐述:1,鬼臼苦素体外抗CML LSC的作用;2,以CML转基因小鼠为模型研究鬼臼苦素在体内抗LSC的作用;3,鬼臼苦素靶向抗CML LSC的分子机制。研究目的本论文通过研究鬼臼苦素体内外抗CML LSC的作用,阐明其分子调控机制,将为PPP研发成为新型的靶向LSC治疗CML的临床药物提供重要的理论和实验基础。研究方法1.探讨鬼臼苦素体外抗人CML LSC的作用1.1利用淋巴细胞分离液分离获得CML患者和健康人(health donor,HD)的骨髓单个核细胞;利用免疫磁珠分选系统对CML和HD的骨髓单个核细胞进行分选,获得CML和健康人的CD34+细胞;流式细胞术鉴定分选出的CD34+细胞纯度。1.2流式细胞术检测PPP诱导的CML和健康人干细胞凋亡情况;克隆形成实验检测PPP处理后CML和健康人CD34+细胞克隆形成数量。2.探讨鬼臼苦素抗SCL-t TA/BCR-ABL转基因小鼠LSC的作用2.1将BCR-ABL转基因小鼠和SCL-t TA转基因小鼠进行杂交得到SCL-t TA/BCR-ABL小鼠(CML小鼠),诱导发病后用流式细胞术和组织HE染色的方法对其表型和组织形态进行鉴定。2.2检测PPP治疗对CML和野生型小鼠体重以及骨髓LSC比例和数目的影响。3.探讨鬼臼苦素抗CML LSC的作用机制3.1 Western blotting检测CML CD34+细胞经过PPP处理后细胞内P53蛋白磷酸化及乙酰化水平;Realtime PCR(q PCR)检测CML CD34+细胞经过PPP处理后P53及其下游调控基因P21、Puma、Noxa、Bax表达水平;q PCR检测CML CD34+细胞经过PPP处理后c-Myc和BCL2表达水平;q PCR检测PPP治疗后小鼠骨髓细胞P21、Noxa和Bax基因表达水平。3.2 q PCR检测CML和健康人骨髓单核细胞、CD34+CD38-细胞、CD34+CD38+细胞IGF1R基因的表达水平;ELISA方法检测CML和健康人骨髓上清中IGF1、IGF2的表达;流式细胞术检测CML和健康人骨髓单核细胞IGF1R蛋白的表达;流式细胞术检测转染IGF1R si RNA后对K562细胞凋亡的影响;Western blotting检测PPP和IGF1R特异性抑制剂(OSI-906和AG-1024)对K562、Ku812细胞内IGF1R活性及其下游调控蛋白活性的影响;流式细胞术检测OSI-906和AG-1024对CMLCD34+细胞凋亡的影响。实验结果1.探讨鬼臼苦素体外抗人CML LSC的作用1.1流式细胞术结果显示,免疫磁珠分选出的CD34+细胞纯度为89.23%,符合实验需求。1.2流式细胞术检测结果显示,PPP能够诱导CML CD34+CD38-(LSC)和CD34+CD38+祖细胞发生显著的细胞凋亡,而对健康人的造血干细胞的凋亡影响较小;克隆形成实验显示,PPP能够明显抑制CML CD34+克隆形成,而对健康人CD34+细胞克隆形成的影响较小。2.探讨鬼臼苦素抗SCL-t TA/BCR-ABL转基因小鼠LSC的作用2.1撤去多西环素4周诱导BCR-ABL表达后,流式细胞术结果显示SCL-t TA/BCR-ABL小鼠的外周血和脾脏中性粒细胞比例明显增高,骨髓LSC比例明显增高;组织HE染色结果显示,SCL-t TA/BCR-ABL小鼠脾脏出现明显的白细胞浸润,骨髓增生明显。2.2经PPP治疗以后,SCL-t TA/BCR-ABL小鼠和野生型小鼠体重没有明显的变化;SCL-t TA/BCR-ABL小鼠骨髓LSC比例和数量明显下降,野生型小鼠骨髓LSC比例无明显变化。3.探讨鬼臼苦素抗CML LSC的作用机制3.1在蛋白水平上,PPP处理后CML CD34+细胞的P53蛋白磷酸化和乙酰化水平并未明显增加;在m RNA水平上,PPP处理后CML CD34+细胞P53基因表达没有发生变化,但是其调控的促凋亡基因P21、Puma、Noxa、Bax表达明显增加,抗凋亡基因c-Myc表达水平明显下降;接受PPP治疗后,SCL-t TA/BCR-ABL小鼠骨髓细胞P21和Noxa表达水平明显上调,与体外实验结果一致;野生型小鼠骨髓细胞P21明显上调,但是Noxa表达无明显变化。3.2流式细胞术和q PCR结果显示CML和健康人体内IGF1R表达水平无明显差异;ELISA结果显示CML和健康人骨髓上清中IGF1R的配体IGF1、IGF2的表达没有明显差异;使用IGF1R si RNA干扰K562细胞IGF1R的表达并不能诱导K562细胞发生明显的凋亡;与IGF1R特异性抑制剂相比,PPP并不能有效的抑制IGF1R的活性或者其下游信号通路;与PPP相比,IGF1R特异性抑制剂诱导CML LSC细胞凋亡的能力明显弱于PPP。结论PPP具有在体内外有效靶向抗CML LSC的药理活性,其机制可能与激活P53信号通路和抑制抗凋亡基因表达相关。