蜡质芽孢杆菌AR156是一株从森林土壤中分离的植物根围促生细菌,用于防治蔬菜上由青枯劳尔氏菌引起的青枯病害,辣椒疫霉引起的系统性枯萎病和南方根结线虫引起的根结线虫病。本文大田试验结果显示,AR156处理番茄能有效的减轻番茄根结线虫病的发生与为害。在此基础上,我们在温室条件下,开展AR156诱导植物抗病性机理研究。研究发现AR156能诱导番茄产生对丁香假单胞番茄致病变种DC3000 (DC3000)的抗病能力。为了进一步阐述这种抗病机理,我们利用模式植物拟南芥进行相关研究,发现AR156诱导拟南芥产生对DC3000的抗病性是通过同时激发水杨酸和乙烯/茉莉酸两个信号通路,从而增强植物抗病性。同时,研究发现根系分泌物在AR156诱导植物抗病性方面起着一定的作用。此外,研究发现miR863-3P能够特异的被Pst DC3000 (avrRpt2)诱导表达,在植物抗病中具有重要的调节作用。为了解析Small RNAs在植物诱导抗病中的调节作用,我们在AR156处理拟南芥及接种病原菌后取样,提取所取样品总RNA,对所取样品构库并测序。拟通过生物信息学分析,找到在诱导抗病调节过程中表达变化显著的Small RNAs,并研究它们的生物学功能。从而解析Small RNAs参与调控诱导抗病性的作用机制,为生防菌AR156的产业化提供理论依据。1.蜡质芽孢杆菌AR156防治番茄根结线虫的田间试验我们在徐州铜山开展AR156合剂大田示范推广实验,AR156合剂用量为8 L/亩。大田试验结果表明使用AR156合剂处理番茄60天后,处理组株高增量46.5%,挂果数增量达55.3%。产量经统计与对照相比,处理组增产38.6%。拔秧时进行病害严重度的统计,处理组对蕃茄根结线虫的平均防治效果为69.3%。同时发现AR156合剂能明显改善番茄品质,与对照相比,可溶性糖、可滴定酸和可溶性固形物均显著提高。分析土壤中速效N、P、K的含量后发现,AR156合剂显著增加这几种物质在根围土中的含量。2.蜡质芽孢杆菌AR156诱导番茄产生对DC3000抗病性本文在温室条件下,研究AR156对番茄的促生作用,以及诱导番茄产生对丁香假单胞番茄致病变种DC3000的抗病能力。在番茄移栽后2周,将悬浮配置好的浓度为1 × 108 CFU/ml菌液缓慢灌入番茄根围,每株20 ml。 5天后叶部接种病原菌DC3000。研究发现,AR156对番茄具有很好的促生作用,生物量增加达47.7%。AR156在番茄根围的定殖量达105-106CFU/g土,并能持续2个月以上。AR156能够诱导番茄产生对DC3000抗病能力,降低病害严重度达1.6倍,并显著抑制病原菌的增殖。此外,AR156处理番茄后能直接激发防卫相关基因的表达。和单独接种病原菌相比,AR156预处理后接种病原菌可以加速防卫相关基因的表达。3.蜡质芽孢杆菌AR156诱导抗病机理研究为了阐述AR156诱导抗病机理,我们利用模式植物拟南芥进行相关研究。拟南芥幼苗生长至4叶时移栽,移栽后2周灌根接种拮抗菌,将悬浮好的5× 108 CFU/ml菌液缓慢灌入拟南芥根围,每株10 m1。本文研究发现AR156能诱导拟南芥生态型Col-0产生对丁香假单胞番茄致病变种DC3000的抗病性。和对照相比,AR156能降低病原菌在叶片的增殖,并对植物表现出较好的促生作用。AR156处理后能直接诱导植物叶片组织防卫相关基因PR1,PR2,PR5和PDF1.2的表达,表明AR156同时激发了水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)/乙烯(ET)信号通路。AR156预处理并接种病原菌后,能激发防卫相关基因的迅速表达,细胞反应应答如过氧化氢的积累和胼胝质的沉积与此相一致。为了研究在此过程中AR156所激发的信号通路,我们检测了AR156在三个突变体和一个转基因植株上诱导抗病性在表型、细胞和分子水平上的差异。结果发现,AR156在NahG, jar和etr1上的生防效果有所降低,而在npr1上的生防效果几乎丧失。AR156预处理植物接种DC3000后12h,在Col-0、NahG、jar1和etr1上均检测到了较强的活性氧爆发和胼胝质沉积,而在nprl上并未观察到类似的现象。此外,AR156预处理拟南芥并接种病原菌DC3000后12h,在Col-0、jar1和etr1上均检测到了PR1基因的表达,在Col-0和NahG上检测到了PDF1.2基因的表达,而在npr1未能检测到PR1和PDF1.2的表达。这些结果表明,AR156诱导拟南芥产生对DC3000的抗病性是通过同时激发水杨酸和乙烯/茉莉酸这两个信号通路,从而增强植物抗病性。为进一步研究AR156的诱导抗病性的机制,我们推测AR156和拟南芥根部互作会产生某些根部分泌物,从而在诱导植物抗病的过程中发挥重要作用。用AR156菌悬液处理拟南芥根部,并在根围加入能够吸附根系分泌物的活性炭；5天后接种病原菌DC3000,发现AR156预处理(未加活性炭)能显著抑制病原菌的侵染,降低病害严重度；而AR156预处理并加入活性炭后,防病效果大大降低,与单独接种病原菌相比无显著性差异。定殖测定结果表明加入活性炭后并不影响AR156在拟南芥根围的定殖能力,由此推测上述诱导抗病能力的降低并非由于影响AR156的定殖能力造成的。结果表明,生防蜡质芽孢杆菌AR156和拟南芥根围互作后产生的根系分泌物在诱导植物抗病性方面起着一定的作用。4. Small RNAs在植物抗病中的调节作用研究发现miR863-3p能够特异的被Pst DC3000 (avrRpt2)诱导表达。我们分别检测了其过表达突变体、靶标突变体的抗病性能力。和野生型相比,靶标At5g61570过表达突变体较为感病,At5g61570和At5g07620双突变体较为抗病,而miR863另一个靶标SERRATE突变体se却对病原菌更为敏感,故miR863在植物抗病中具有重要的调节作用。为了研究Small RNAs在AR156介导的诱导抗病性作用,我们在AR156处理拟南芥及接种病原菌后分别取样,构建Small RNAs文库,通过高通量测序和生物信息学分析,拟发现在植物诱导抗病中表达变化的Small RNAs,近而研究它们在抗病中的调节机制。首先提取植物样品总RNA,并纯化20-30 nt的Small RNAs.将纯化后的产物连接3`接头并纯化,纯化后连接5`接头。连接产物做RT-PCR,扩增得到cDNA文库。并构建TA克隆,检测构建文库质量。5.总结本研究的主要发现和创新：第一,首次发现蜡质芽孢杆菌能同时诱导水杨酸和乙烯/茉莉酸信号通路,从而增强植物抗病能力；第二,miR863在植物抗病中具有重要的调节作用。本研究中也存在以下不足：第一,由于缺少突变体种子,没能在番茄上验证AR156诱导抗病依靠的信号物质；第二,没能深入研究根系分泌物在AR156诱导抗病中的调节作用。