目的:子宫内膜异位症,又可称之为内异症,是指有功能的子宫内膜组织在子宫腔被覆内膜以外的部位浸润生长,并随月经出现周期性脱落和出血,主要临床症状表现为慢性盆腔痛、经期腹痛、性交不适以及不孕等。内异症是育龄期妇女的常见疾病之一,影响约10%的育龄期妇女,在不孕及慢性盆腔痛的患者中发病率可高达50%。虽然子宫内膜异位症是一种良性疾病,但仍具有远处转移、组织粘连、组织侵袭、植入和复发等恶性生物学行为。转化生长因子β(Transforming growth factorβ,TGF-β)是一种多功能的细胞因子,具有调节细胞分化、增殖、血管生成和免疫反应的功能。研究发现子宫内膜异位症患者腹腔液和血液中TGF-β表达水平异常升高,提示TGF-β信号通路在子宫内膜异位症的发病中发挥重要作用,TGF-β通过跨膜I型(TGF-βreceptor 1,TGFBR1)和II型(TGF-βreceptor 2,TGFBR2)受体启动下游信号通路。当与TGF-β结合时,TGFBR2募集并激活TGFBR1,进而磷酸化其下游关键信号分子SMAD2和SMAD3蛋白。激活的SMAD2/3蛋白随后与SMAD4结合并转移到细胞核以调节后续基因的表达。TGF-β/SMAD信号通路通过调节多种病理生理过程参与子宫内膜异位症的发病过程,其中对上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的研究非常广泛。EMT以细胞极性丧失、细胞接触和间充质表型增加为特征,进而诱导上皮细胞迁移和侵袭性增加,在子宫内膜异位症的发生及进展中发挥重要作用。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一类长度为20-25个核苷酸的内源性单链非编码小RNA,可以与靶基因的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)结合,通过抑制m RNAs的翻译或降解,在转录后水平负向调控其表达,micro RNA参与多种细胞功能,包括细胞分化、增殖、凋亡、迁移和侵袭。近年来,许多研究表明micro RNAs在子宫内膜异位症患者循环中的表达显著失调,提示micro RNA可能是子宫内膜异位症潜在的治疗靶点。mi R-96-5p是mi R-183-96-182簇的一个成员,在肝细胞癌、甲状腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、宫颈癌、乳腺癌和骨肉瘤等多种肿瘤中,mi R-96-5p具有促癌或抑癌作用。然而,截至目前,mi R-96-5p在子宫内膜异位症中的具体作用还没有研究。方法:使用RT-q PCR检测子宫内膜异位症患者在位及异位内膜组织中mi R-96-5p表达水平。使用RT-q PCR和western blot检测了TGFBR1和SMAD3在子宫内膜异位症患者在位及异位内膜组织中表达水平。构建mi R-96-5p过表达及敲低的子宫内膜细胞Ishikawa及End1/E6E7细胞系,通过RT-q PCR检测mi R-96-5p mimics与inhibitor的转染效率。使用CCK-8检测过表达及敲低mi R-96-5p的子宫内膜细胞增殖能力的变化,使用划痕实验检测过表达及敲低mi R-96-5p的子宫内膜细胞迁移能力的变化,使用Transwell实验检测过表达及敲低mi R-96-5p的子宫内膜细胞侵袭能力的变化。构建TGFBR1敲低的子宫内膜细胞Ishikawa及End1/E6E7细胞系,通过RT-q PCR检测TGFBR1小干扰RNA的转染效率。使用CCK-8检测敲低TGFBR1的子宫内膜细胞增殖能力的变化,使用划痕实验检测敲低TGFBR1的子宫内膜细胞迁移能力的变化,使用Transwell实验检测敲低TGFBR1的子宫内膜细胞侵袭能力的变化。利用生物信息学软件预测mi R-96-5p与TGFBR1的结合位点,根据预测的结合序列构建野生型TGFBR1 3’-UTR或突变型TGFBR1 3’-UTR载体,与mi R-96-5p mimics或阴性对照共转染HEK293T细胞,并进行双荧光素酶报告分析检测。使用RT-q PCR和western blot检测过表达mi R-96-5p的子宫内膜细胞Ishikawa及End1/E6E7细胞系中TGFBR1表达水平的变化。分别用不同浓度的TGF-β1(0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml)处理Ishikawa及End1/E6E7细胞系,使用RT-q PCR和western blot检测TGFBR1,TGFBR2,SMAD3表达水平的变化。使用western blot检测E-cadherin,N-cadherin,vimentin表达水平的变化。在使用最适浓度TGF-β1处理的Ishikawa及End1/E6E7细胞系中分别转染mi R-96-5p及其对照,western blot验证TGFBR1,TGFBR2,SMAD3,E-cadherin,N-cadherin,vimentin表达水平的变化。使用CCK-8检测TGF-β1处理后过表达mi R-96-5p的子宫内膜细胞增殖能力的变化,使用划痕实验检测TGF-β1处理后过表达mi R-96-5p的子宫内膜细胞迁移能力的变化,使用Transwell实验检测TGF-β1处理后过表达mi R-96-5p的子宫内膜细胞侵袭能力的变化,研究mi R-96-5p通过靶向TGFBR1及其介导的TGF-β/SMAD信号通路对子宫内膜细胞生物学行为的影响。结果:在本研究中,mi R-96-5p在异位内膜组织中的表达较在位内膜组织明显降低,TGFBR1与SMAD3在异位内膜组织中表达显著高于在位内膜组织。mi R-96-5p与TGFBR1表达水平呈负相关。在子宫内膜细胞系Ishikawa与End1/E6E7中,CCK-8显示过表达mi R-96-5p抑制细胞增殖,划痕实验及transwell实验显示过表达mi R-96-5p抑制细胞迁移与侵袭。敲低mi R-96-5p对细胞生物学行为的影响与过表达mi R-96-5p相反。此外,CCK-8显示敲低TGFBR1抑制细胞增殖,划痕实验及transwell实验显示敲低TGFBR1抑制细胞迁移与侵袭。生物信息学软件预测mi R-96-5p与TGFBR1存在潜在结合位点,双荧光素酶报告分析实验证实二者可直接结合。在子宫内膜细胞系Ishikawa与End1/E6E7中过表达mi R-96-5p可显著抑制TGFBR1的表达。TGF-β1处理后子宫内膜细胞系Ishikawa与End1/E6E7中TGFBR1、TGFBR2和SMAD3的表达显著增加,证实TGF-β1在子宫内膜细胞系中激活了TGF-β/SMAD信号通路;E-cadherin表达降低,N-cadherin和vimentin表达增加,说明TGF-β1可诱导子宫内膜细胞系发生上皮间质转化。恢复实验表明,在TGF-β1刺激后,mi R-96-5p过度表达抑制了TGFBR1和SMAD3的表达,但TGFBR2的表达没有明显变化,说明mi R-96-5p可能通过靶向TGFBR1抑制了TGF-β1对TGF-β/SMAD信号通路的激活,此外过表达mi R-96-5p的子宫内膜细胞系内E-cadherin表达升高,N-cadherin和vimentin表达降低,说明过表达mi R-96-5p可以部分逆转TGF-β1诱导的上皮间质转化。CCK-8,划痕实验及transwell实验说明TGF-β1对子宫内膜细胞的增殖、迁移、侵袭具有促进作用,过表达mi R-96-5p可以抑制TGF-β1对细胞生物学行为的促进作用。结论:1.miR-96-5p在内异症患者异位内膜组织中低表达,TGFBR1在内异症患者异位内膜组织中高表达。2.miR-96-5p靶向结合TGFBR1。3.mi R-96-5p可通过负向调控TGFBR1抑制子宫内膜细胞的生物学行为,逆转上皮间质转化现象。