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目的:(1)利用HPLC法测定不同发育时期栀子果实中6种有效成分的含量,明确其变化规律。(2)运用转录组学和代谢组学对栀子果实进行研究,解析栀子果实发育成熟过程中转录与代谢的调控机制,通过组学联合分析,鉴定果实中环烯醚萜与西红花苷类成分生物合成途径中的关键基因,为栀子有效成分生物合成的研究及分子辅助育种提供理论基础。方法:(1)含量测定根据栀子果实发育的颜色变化特点,历经绿色、黄绿、黄、黄红、红色的变化过程,将其分为幼果、青果、黄果、黄红果和红果五个发育时期,采集五个发育时期的栀子果实,利用HPLC法测定栀子苷、京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ和绿原酸6种有效成分的含量。(2)转录组学分析利用高通量测序技术对不同发育时期的栀子果实进行研究,使用公共数据库对各样本中的基因进行比对和功能注释,使用DESeq2对获得的基因进行差异表达分析,基于STEM时序聚类算法分析基因的表达趋势,运用GO、KEGG数据库对差异表达基因进行功能富集分析。(3)代谢组学分析采用非靶向代谢组学技术研究栀子不同发育时期果实中代谢物的种类、数目和相对含量变化,结合多元统计与单维统计分析筛选差异代谢物,层级聚类分析揭示不同果期差异代谢物的变化,利用KEGG数据库对栀子果实中的差异代谢物进行功能通路注释和富集分析。(4)联合分析将转录组学与代谢组学的数据联合分析,鉴定参与栀子环烯醚萜与西红花苷类成分生物合成途径的差异表达基因和代谢物,从转录与代谢的角度解析栀子果实发育成熟过程中两类成分的生物合成途径。基于Spearman相关性分析,构建差异表达基因-代谢物的相关性网络,进一步挖掘栀子中与环烯醚萜和西红花苷类成分相关的功能基因,应用STRING数据库对栀子果实中两类成分生物合成途径的基因构建蛋白互作网络,通过Cytoscape软件对其进行可视化分析。结果:(1)含量测定结果表明,栀子不同发育时期果实中有效成分的含量和变化规律有一定的差异,栀子苷、京尼平苷酸和绿原酸在幼果期含量达到峰值,随着栀子果实的发育成熟,含量呈逐渐下降的趋势;京尼平-1-β-龙胆双糖苷的含量在栀子的幼果期含量最低,随着栀子果实的发育成熟,在黄红果期达到峰值,随后在红果期含量稍下降,呈先上升后下降的趋势;而西红花苷类成分在栀子果实发育初期并未合成,随着栀子果实的发育成熟,其含量呈逐渐升高的趋势,在红果期达到了峰值。(2)利用转录组测序技术对栀子发育成熟过程中五个时期果实的15个样本进行研究,总共获得103.63Gb的测序数据,组装后得到77310个基因,对不同发育时期的栀子果实进行差异分析,共获得17284个差异表达基因,其中栀子幼果期与红果期的差异表达基因数目最多为9375个,黄果期与黄红果期的差异表达基因数目最少为1068个。基于时序分析对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析,发现栀子果实在生长发育过程中需要多种酶的催化与调节,还涉及到多种次生代谢物质的生物合成通路,包括苯丙烷生物合成、类胡萝卜素生物合成、萜类骨架生物合成等途径。(3)利用非靶向代谢组学对栀子不同发育时期果实中的代谢物进行研究,共鉴定743种代谢物,按照KEGG数据库中植物次生代谢物类型可以分为6个类别,其中黄酮类、萜类、苯丙烷类代谢物数目较多,分别为28、26、21个。运用多元统计分析和T检验筛选得到352个差异代谢物,上调的代谢物有238个,下调的代谢物有1 14个,对其进行KEGG功能注释和富集分析,发现在栀子果实发育成熟过程中,氨基酸代谢、次生代谢物质的生物合成、ABC转运蛋白与碳代谢是较为显著的通路。(4)经转录组学与代谢组学的联合分析,构建栀子环烯醚萜类成分的生物合成途径,鉴定该途径中29个基因编码的14种酶(ACAT、HMGCS、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、DXS、DXR、ispD、ispE、ispH、IDI、GPPS、10HGO)与8种代谢物;在西红花苷类成分生物合成途径中鉴定27个基因编码的16种酶(DXS、DXR、ispD、ispE、ispH、GPPS、IDI、crtB、PDS、Z-ISO、ZDS、crtISO、1cyB、CCD4a、UGT75L6、UGT94E5)与6种代谢物。并对上述基因和代谢物在栀子果实发育成熟过程中的变化进行了动态分析。差异表达基因与代谢物相关性网络结果表明,栀子果实中与环烯醚萜类成分高度相关的基因有211个,与西红花苷类成分高度相关的基因有153个。(5)基于STRING数据库对栀子果实中环烯醚萜和西红花苷两类成分合成途径的基因进行蛋白网络互作分析,根据互作网络中每个基因节点的连通性(Degree)大小,从而获得两类成分生物合成途径中的关键基因。经分析得到栀子环烯醚萜类成分生物合成途径中的关键基因为HMGCR,西红花苷类成分生物合成途径中的关键基因为DXS、DXR、PDS3和PSY。结论:(1)测定了栀子不同发育时期果实中6种有效成分的含量,明确其变化规律。在栀子果实生长发育过程中,不同有效成分的含量和变化规律有一定的差异,它们受到果实发育阶段的影响,以栀子苷为代表的环烯醚萜类成分主要呈下降的变化趋势,而西红花苷类成分则呈上升的变化趋势,二者在栀子果实中呈相反的积累模式。(2)基于转录组学和代谢组学对栀子5个发育时期的果实进行联合分析,鉴定了参与环烯醚萜类成分生物合成途径中8种代谢物和29个基因编码的14种酶,其中起关键调控作用的基因是HMGCR;在西红花苷类成分生物合成途径中,鉴定了 6种代谢物和27个基因编码的16种酶,其中起关键调控作用的基因是DXS、DXR、PDS3和PSY,这些关键基因可能对栀子环烯醚萜和西红花苷类成分的生物合成起重要调节作用。本研究解析了栀子果实中环烯醚萜和西红花苷类成分的生物合成途径,鉴定了两类有效成分生物合成的关键基因,有利于促进栀子的进一步开发与利用,并为栀子的遗传研究和分子辅助育种提供理论基础。