超低温保存被认为是目前最理想的植物种质资源长期保存的方法。在诸多研究中发现,不同实验室用同样的方法保存同一基因型时再生率有很大差异。探明导致这种情况发生的原因无疑将有利于不同实验室超低温基因库的建立。病毒病害是制约苹果生产可持续发展的主要因素之一,无毒苗的培育是生产上防止病毒病害的核心技术。苹果茎痘病毒(apple stem grooving virus,ASGV)是一种难以脱除的病毒,建立该病毒的高效脱毒新技术有利于苹果产业的发展。带毒材料是病毒基础研究和应用研究的前提条件。病毒是专性病原体,必须依赖寄主才能复制与增殖。因此,病毒的长期保存十分困难。建立病毒高效、安全、长期的保存技术可为病毒的基础研究和应用研究提供病原材料。本研究旨在:(1)比较苹果带毒(ASGV)茎尖与无毒茎尖超低温保存后再生的差异,并探讨病毒导致茎尖超低温保存后再生力低的原因;(2)建立热处理结合茎尖超低温疗法高效脱除ASGV的技术,并揭示其脱毒机理;(3)建立茎尖超低温保存ASGV的技术,并证明该技术保存病毒的有效性。本研究获得的主要研究成果如下:1.以苹果‘Gala’单感ASGV和无毒试管苗为试材,用小滴玻璃化(droplet-vitrification)保存茎尖。结果表明,带毒茎尖与无毒茎尖的成活率和再生率均没有明显差异。但无毒茎尖的再生速度快于带毒茎尖,且均再生正常的茎。带毒茎尖表现出三种再生类型:正常茎、莲座茎和莲座茎带不正常叶片,三种再生类型的比例分别为45%,32%和23%。ASGV带毒苗和无毒苗在继代培养基上培养4周后,带毒苗形成的茎数/株为7.2,明显高于无毒苗(5.1)。无毒苗形成的≥1.0 cm和<1.0 cm但≥0.5 cm的茎数为2.9和2.2,且没有<0.5 cm的茎。带毒苗形成的≥1.0 cm、<1.0 cm但≥0.5cm和<0.5 cm的茎数分别为1.8、2.8和2.6,分别占总茎数的25%、38.9%和36.1%。无毒苗的生长素(IAA)和玉米素(ZR)含量分别为15.9和14.3μg/g,明显高于带毒苗(12.4μg/g和11.2μg/g)。带毒苗的可溶性糖、可溶性总蛋白和脯氨酸水平分别为11.1 mg/g、8.7 mg/g和17.2μg/g,分别比无毒苗高16%、30%和28%。无毒苗的电解质渗出率为8.1%,明显低于带毒苗(9.8%)。组织切片对超低温保存后成活细胞在茎尖的分布结果表明:无毒茎尖的成活细胞分布在顶端分生组织1-8层和第1-4叶原基,成活细胞的比例分别为62%和34%。而带毒茎尖的成活细胞分布在顶端分生组织1-5层和第1-4叶原基,成活比例分别为46%和30%。细胞超微结构研究表明:无毒茎尖和带毒茎尖的超微结构大致相似,唯有线粒体形态有所不同:无毒茎尖细胞的线粒体为卵形(正常),而带毒茎尖细胞的线粒体明显加长。带毒试管苗生长素和玉米素的降低可能导致试管苗茎数量的增加和长度降低。病毒引起的细胞膜伤害(电解质渗出率上升)和线粒体超微结构的变化可能降低细胞对超低温的抗性,进而导致再生正常茎的能力降低。2.以单感ASGV的苹果‘Gala’试管苗为试材,成功建立了热处理结合小滴玻璃化法茎尖超低温疗法脱除ASGV的技术。将带毒试管苗置于36 ~o C/32 ~o C(白天/夜间)光照条件下热处理4周,从热处理后的试管苗上取1.5 mm(带3-4叶原基)的茎尖,经小滴玻璃化超低温处理或茎尖培养,获得再生试管苗。待试管苗移入温室生长10个月后,用RT-PCR检查植株的带毒情况。结果表明,热处理不会影响带毒试管苗的成活,但明显影响试管苗的营养生长:热处理后植株茎的长度为2.5 cm,显著低于对照(3.5 cm);但增殖率(4.7)明显高于对照(2.5)。超低温疗法后的茎尖再生率随热处理周数的延长而明显下降,但脱毒率明显上升。热处理4周的脱毒率为100%。热处理后茎尖培养的再生率(78%)高于超低温疗法(44%),但前者的脱毒率(26%)明显低于后者(100%)。热处理结合茎尖超低温疗法分别得到了100%(‘Fuji’)、40%(‘浓果25’)、30%(‘瑞雪’)和83%(‘M9’)的脱毒率。免疫组织化学法对ASGV在‘Gala’和‘瑞雪’茎尖的定位表明:ASGV可感染两个苹果品种的顶端分生组织和幼嫩叶原基。随着热处理周数的增加,茎尖顶端分生组织的无毒区明显扩大。热处理4周后,‘Gala’茎尖的分生组织和第1-5片叶原基不能定位到病毒,而‘瑞雪’茎尖的第4叶原基中能明显定位到病毒。超低温疗法处理后,‘Gala’和‘瑞雪’的茎尖顶端分生组织和第1-3片叶原基中有大量细胞成活,但‘Gala’在第4叶原基中仅有少量细胞成活,而‘瑞雪’的第四片叶原基中有较多细胞成活。病毒在不同基因型茎尖中分布的不同和超低温处理后的茎尖细胞成活模式的差异解释了不同基因型中存在脱毒率差异的原因。3,以单感ASGV的苹果‘Gala’试管苗为试材,用小滴玻璃化法(droplet-vitrification)和包埋干燥法(encapsulation-dehydration)分别处理茎尖,获得62-67%的再生率。再生试管苗经RT-PCR检测,两种茎尖超低温方法所获得的再生苗ASGV带毒率均为100%。与带毒试管苗(对照)比较,超低温保存后带毒苗继代培养8周后的增殖率和病毒浓度明显低于对照,但继代培养16周后的增殖与病毒浓度与对照相似。使用试管苗微型嫁接技术将超低温保存后的带毒苗嫁接在苹果‘Gala’无毒试管苗上,嫁接21天后的传毒率为100%。将超低温保存后的病毒使用摩擦接种技术侵染烟草叶片,接种21天后,明显观察到烟草叶片上的病毒症状。应用RT-PCR法在显示症状的叶片中检测到了病毒。对超低温保存的ASGV病毒的三个基因片段(包括编码外壳蛋白和运动蛋白)的测序结果表明,超低温保存后的ASGV与对照ASGV基因序列的相似性为99.87%。本研究获得的结果为使用无毒材料超低温保存植物种质资源提供了理论依据。热处理结合茎尖超低温疗法为脱除难脱除的植物病毒提供了新的技术。茎尖超低温病毒保存技术为植物病毒的安全、长期、高效保存开辟了新的途径。