山莓(Rubus corchorifolius L.f.)属蔷薇科悬钩子属一种落叶灌木。山莓叶具有丰富的营养和保健作用。本文以山莓叶为研究对象,采用溶剂萃取、柱层析和结晶等分离纯化的方法对山莓叶醇提物的乙酸乙酯萃取组分进行分离纯化,并对分离纯化的单体化合物进行结构鉴定。采用MTT法对分离的化合物进行抗肿瘤活性检测。采用流式细胞仪分析化合物对细胞周期、凋亡、细胞线粒体膜电位和钙离子离浓度的影响;采用Western blot分析化合物对肿瘤细胞蛋白的影响,采用iTRAQ标记定量蛋白组学技术研究新型二萜化合物作用HCT-116细胞后的蛋白组学的变化。研究研究内容和结果如下:(1)山莓叶中萜类和酚类物质的分离纯化及结构鉴定通过溶剂萃取、常压柱层析、中压柱层析、薄层层析和结晶等分离纯化方法,对山莓叶的乙醇提取物中乙酸乙酯萃取物进行分离纯化。采用核磁(1H-NMR、13C-NMR、HMBC、HSQC)、质谱、X-单晶衍射分析和文献数据进行比对的方法对分离的单体化合物进行结构鉴定。结果表明:山莓叶乙酸乙酯萃取组份共分离纯化出10个化合物,分别为:16β,17-二羟基-3-氧-贝壳杉烷(1),贝壳杉烷-3α,16β,17-三醇(2),对映-贝壳杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮缩酮(3),对映-贝壳杉-3α,16β,17-三醇(4),对映-贝壳杉-16α,17二羟基-2酮(5),对映-贝壳杉-16β,17,19-三醇-3-酮(6),对映-贝壳杉烷-2α,16β,17-三醇(7),2α、3β、23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸(8),对羟基肉桂酸乙酯(9),阿魏酸乙酯(10)。其中2个新化合物为对映-贝壳杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮缩酮(3)和对映-贝壳杉-16β,17,19-三醇-3-酮(6)。首次在山莓叶发现了16β,17二羟基-3-氧-贝壳杉烷(1),贝壳杉烷3α,16β,17三醇(2)和对映-贝壳杉3β,16β,17三醇(4)3个化合物。首次研究了贝壳杉烷-3α,16β,17-三醇(2),对映-贝壳杉-16α,17二羟基-2酮(5)和对映贝壳杉烷2α,16β,17-三醇(7)3个化合物的单晶结构。(2)山莓叶中10种单体化合物的抗肿瘤活性筛选及化合物4和8的作用机制研究采用MTT法检测了分离出的10个化合物对人肝癌细胞(HepG2)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人胃癌细胞(SCG-7901)、人卵巢癌细胞(OVCAR3)和人结肠癌细胞(HCT-116)5种癌细胞的增殖抑制作用。结果表明:化合物3、4和8对HCT-116细胞具有很好的抑制作用,其IC50分别是40.00±1.78μM、29.84±2.35μM和26.84±2.12μm。化合物9和10对hepg2抑制作用的ic50分别为28.17±1.20μm和26.2±2.1μm。化合物10在6.25~100μm时对正常lo2细胞的生长增殖没有明显的抑制作用,而化合物9在浓度为50μm和100μm时对lo2细胞的抑制率分别为25%和20%。化合物3在6.25~100μm对ccd-18co细胞的生长没有明显的抑制作用;化合物4在6.25~100μm时对ccd-18co细胞和生长和增殖有轻微的抑制作用;化合物8在6.25~25μm时对ccd-18co细胞没有明显的抑制作用,而当浓度为100μm时对ccd-18co细胞生长增殖具有明显的抑制作用。采用流式细胞仪和westernblot技术研究了化合物4和8的对hct116细胞的作用机理,结果表明:化合物4和8通过阻滞细胞周期于g0/g1期、促进细胞凋亡,并能从蛋白水平上调促凋亡蛋白cleavedparp、cleavedcaspase-3、p53蛋白的表达和下调促周期进程蛋白cyclind1、p27、cdk2和cdk4的表达。(3)山莓叶中阿魏酸乙酯诱导hepg2细胞凋亡及作用机制研究采用显微镜观察、流式细胞术和westernblot等方法从细胞形态、细胞周期和细胞凋亡等方面研究阿魏酸乙酯(化合物10)对hepg2细胞的抑制作用及其作用机制。结果表明:15~35μm阿魏酸乙酯作用hepg2细胞72h时,细胞数量减少,轮廓变圆,漂浮,具有浓度依赖性;而对正常肝细胞lo2没有明显毒性。阿魏酸乙酯作用后的hepg2细胞,经过dapi染色后,与空白对照相比,细胞明显皱缩变亮,部分凋亡细胞核还发生了裂解,程度随浓度的增加而增加,呈现典型的凋亡形态。阿魏酸乙酯作用后的hepg2细胞,经过annexinv-fitc/pi染色流式细胞仪检测,发现其作用浓度为15μm和35μm,细胞凋亡率(annexinv-fitc+区)分别是空白对照组的1.6倍(从6.27%升至10.04%)和10倍(从6.27%升至62.95%)。阿魏酸乙酯能诱导hepg2细胞凋亡,并具有浓度依赖关系。阿魏酸乙酯作用hepg2细胞后,经过pi染色,流式细胞仪检测,发现阿魏酸乙酯对细胞周期具有阻滞作用,当其浓度为15~20μm可以阻滞细胞于g0/g1期;当浓度为25~35μm时,可以阻滞细胞于s期。阿魏酸乙酯可以降低hepg2细胞的线粒体膜电位,当其浓度从15μm升至35μm时,其细胞线粒体膜电位从29a.u下降到14.2a.u,呈现一定的量效关系。阿魏酸乙酯能提高hepg2细胞内钙离子的浓度,当浓度为15μm和35μm时分别是对照组3.0和4.5倍。westernblot实验进一步证明阿魏酸乙酯作用hepg2细胞后能激活促凋亡蛋白cleavedparp、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、p53、bax和周期阻滞蛋白p21的表达,而抑制促周期进程蛋白cyclin D1的表达。(4)山莓叶中新型二萜化合物DEK诱导HCT116细胞凋亡及作用机制研究采用显微镜观察和流式细胞术,从细胞形态、细胞体膜电位、细胞内钙离子浓度等方面研究新型二萜化合物对映-贝壳杉-2-酮-16β,17,-二醇-丙酮缩酮(简称DEK)对HCT116细胞凋亡特性及抗肿瘤机制研究。结果表明:DEK诱导HCT116细胞凋亡主要是通过作用细胞的形态、促进细胞凋亡、降低细胞体膜电位并将细胞周期阻滞在S期。iTRAQ标记定量蛋白组学技术分析检测DEK作用HCT116细胞后细胞中蛋白分子表达量变化,共获得有统计学意义差异蛋白120个(P<0.05),其中53个蛋白为表达量下调,67个蛋白表达量上调。与肿瘤有关的上调和下调差异蛋白主要参与了酶调节活性、电子传递功能、抗氧化活性、蛋白结合转录活性,细胞的代谢、细胞生理和应激反应等。差异蛋白主要作用结直肠癌通路、氧化磷酸化通路、细胞周期、p53通路和Wnt等通路,在这些通路中对抑制肿瘤的发生发展具有重要的作用。差异蛋白中,其中下调蛋白Rac、Rho A、Rac1、Cdc42、SDHB、NDUFS6、COX6B1、ATP6、NDUFA9和上调蛋白14-3-3σ具有促进肿瘤细胞的凋亡、阻滞细胞细胞周期、抑制细胞增殖、迁移和侵袭和肿瘤血管生成等作用。Western blot蛋白验证实验表明:iTRAQ定量蛋白的表达趋势与Western blot分析的结果相吻合。