蜡梅DRM1/ARP家族鉴定及CpDRM3-2基因功能分析

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休眠是植物生长发育暂停的现象,是植物度过不良环境的一种适应性机制。DRM1/ARP家族属于生长素抑制超家族,可以作为植物的休眠标记,影响植物的生长发育。目前,关于蜡梅DRM1/ARP家族在休眠中的功能以及分子调控机制尚不明确。为了研究蜡梅DRM1/ARP家族基因的功能特点,本研究利用本地HMMER的方法对蜡梅DRM1/ARP家族进行全基因组鉴定;以‘素心’蜡梅(Chimonanthus praecox var.concolor)为材料,克隆得到CpDRM3-2基因,并对其进行重点研究;通过q PCR分析了CpDRM3-2在蜡梅中的时空表达模式和不同胁迫诱导下的反应;通过构建CpDRM3-2基因过表达载体并转化拟南芥,初步探讨了CpDRM3-2基因的功能。主要研究结果如下:(1)本研究在蜡梅基因组中鉴定出5个DRM1/ARP家族成员,按照其所在的Scaffold编号以及蜡梅与不同物种DRM1/ARP家族同源蛋白序列的系统发育树分析结果,将五个家族成员分别命名为Cp DRM1/3-1/3-2/4-1/4-2。蜡梅DRM1/ARP家族五个成员的序列长度差异很大,在434bp~6585bp之间,CDS介于330bp~606bp间,内含子数量较少,在1~3之间。Cp DRMs编码的蛋白是一类具有高等电点的小肽蛋白,且是不稳定的,亲水的蛋白;均无信号肽和跨膜结构,可能是一类胞质蛋白;蛋白质二级结构也较为简单。亚细胞定位预测表明Cp DRMs蛋白可能主要作用于细胞核,其中Cp DRM4-2还可能作用于线粒体。多重比对、蛋白结构分析及系统发育树分析表明,Cp DRM1与其它四个成员的同源性相对较低,Cp DRM3-1与CpDRM3-2有较高同源性,Cp DRM4-1与Cp DRM4-2有较高同源性。在与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、无油樟(Amborella trichopoda)、葡萄(Vitis vinifera)、荷花(Nelumbo nucifera)和水稻(Oryza sativa)同源蛋白序列的系统发育树分析发现,Cp DRM3-1/3-2与葡萄Vv DRM3和无油樟At DRM3的亲缘关系较近,Cp DRM4-1/4-2与荷花Nn DRM4的亲缘关系较近,Cp DRM1与无油樟At DRM1的亲缘关系最近。分析低温打破蜡梅花芽休眠并使其膨大开放的转录组数据库中DRM1/ARP家族的表达模式,结果表明Cp DRM1/3-2/4-1/4-2在16℃处理下不能始花的花芽(n F16)中的表达量较高,在开始进行需冷量积累至始花的整个过程中表达量较低,而Cp DRM3-1的表达模式完全相反。(2)为了研究CpDRM3-2在蜡梅中的功能,本实验运用实时定量RT-RCR(q RT-RCR)检测了CpDRM3-2在蜡梅不同花发育时期、不同器官以及不同胁迫条件下的表达特性。结果显示:蜡梅花芽在夏季高温时期的休眠阶段,CpDRM3-2的表达量相对较高,在花芽进行需冷量累积阶段,CpDRM3-2的表达量显著下降,到露瓣期和始花期时,其表达量降至最低,表明CpDRM3-2在蜡梅花芽休眠中起着重要调控作用。此外,CpDRM3-2在蜡梅不同的器官中均有表达,在根中的表达量最高,表明CpDRM3-2可能参与了蜡梅根生长发育的调控。同时发现,除根外,CpDRM3-2在蜡梅非成熟的器官中的表达量高于成熟器官,如,雌/雄蕊高于花被片,幼果高于茎、叶和花。在高温(42℃)、低温(4℃)和NaCl等不同非生物胁迫下,以及在激素ABA和Me JA的处理下,CpDRM3-2基因均被诱导呈显著上调表达。(3)为了进一步研究CpDRM3-2基因的功能,本实验构建了CpDRM3-2过表达载体,并通过农杆菌介导的花序侵染法转化野生拟南芥,经PCR鉴定后获得转基因阳性株系,利用含Kan的培养基连续筛选至T2代获得纯合的35S::CpDRM3-2/拟南芥过表达株系。通过q RT-PCR检测各株系CpDRM3-2的表达量,筛选出OE6-10、OE7-3和OE5-5三个过表达株系用于后续实验。表型观察发现,相比于WT,35S::CpDRM3-2/拟南芥株系的根系生长以及下胚轴伸长均被抑制,而且种子的发芽率也明显低于WT。然而,过表达拟南芥的生长发育过程却被促进,生长速度及莲座叶、角果、株高等的生物量都优于WT,这与以往的研究相矛盾,可能是由于在不同物种中同源基因仍然具有其特异性。
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