研究目的甲状腺相关眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)是眼眶疾病中最常见的一种类型。目前的研究认为其是一种自身免疫性疾病,与甲状腺功能紊乱有关,常伴发于毒性弥漫性甲状腺肿(Graves’disease,GD)。国外研究显示,每百万人群中Graves病发病率为210/年,男女比例为1:3.9,高峰年龄为40-60岁,而TAO的发病率为42.2/百万/年,约为Graves甲亢发病率的20.1%。目前TAO的确切发病机制仍不明确,缺乏针对性的治疗措施,现有治疗方案多以控制病情为主。同时由于TAO治疗的前提是正确的临床分期,而目前临床普遍采用的CAS评分系统存在一定的主观性,尤其对于非专门从事TAO诊治的眼科和全科医生,很难做到准确分期。国外有研究发现,Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)激活可促进浆细胞样DC(pDC)分泌IFN-α,与SLE的疾病活动性和预后密切相关。而我们前期研究发现活动期TAO患者外周血单个核细胞中TLR9表达明显高于正常人群。因此我们推测TLR9是否同样参与了TAO的发病过程,为了验证这一设想,通过实验验证活动期TAO患者眼眶成纤维细胞(orbital fibroblasts,OFs)是否高表达TLR9,并与稳定期TAO进行对比,以期发现二者之间TLR9表达的差异。进一步探究TLR9与OFs增殖、炎症因子释放之间的联系,了解TLR9在TAO发病中的作用,为寻找TAO治疗靶点提供依据和方向。研究方法本课题通过组织块培养法,分别从活动期TAO患者、稳定期TAO患者及排除免疫性疾病为改善外观而行眼眶减压手术的正常人眼眶脂肪结缔组织中分离纯化OFs。用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)方法分析各组TLR9mRNA表达水平的差异。用TLR9特异性配体——人工合成的含有CpG基序的寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)刺激各组细胞,分别于刺激后0h、6h、12h、24h用qRT-PCR方法检测白介素-6(interleukins-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1,ICAM-1)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)mRNA表达水平的变化趋势,并分别用不同浓度CpG ODN刺激各组OFs,作用不同时间,通过CCK8法测定各组细胞OD值的变化,计算细胞活力,了解TLR9与OFs增殖之间的联系。最后用特异性小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)下调TLR9 mRNA的表达水平,再次用qRT-PCR法检测活动期TAO组TLR9、IL-6、IFN-γ、ICAM-1 mRNA表达水平,验证TLR9与炎症因子IL-6、IFN-γ、ICAM-1合成和分泌之间的相关性。结果1、经组织块培养法成功获得各组OFs,经形态学及免疫组化鉴定符合成纤维细胞特征。2、TLR9 mRNA在活动期TAO组OFs中表达水平明显高于正常对照组,而在稳定期TAO组中表达下调。3、CpG-ODN刺激各组细胞后,活动期TAO组OFs活力明显升高,而稳定期TAO组和正常对照组无明显变化,这种作用在CpG-ODN作用48h后显现,并且存在剂量依赖,在200nM时最明显。4、CpG-ODN刺激各组细胞后,活动期TAO组OFs相关炎症因子(IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ)mRNA的表达水平均不同程度升高,稳定期TAO组OFs升高幅度不明显,部分出现下调。5、用siRNA下调活动期TAO组OFs TLR9 mRNA表达水平后,相关炎症因子(IL-6、IFN-γ、ICAM-1)mRNA的表达水平亦呈现下降趋势,呈正相关。结论1、组织块培养法获取OFs是可靠而有效的。2、TAO活动期患者来源的OFs高表达TLR9,而稳定期患者来源的OFs相对低表达,提示TLR9可能参与TAO活动期炎症反应过程。3、用特异性配体激活TLR9后,OFs的细胞活力明显提高,提示TLR9被激活可能参与了TAO活动期眼外肌增生和眶脂肪增多的病理过程。4、TLR9激活后,可诱导活动期OFs合成和分泌IL-6、TNF-α、ICAM-1、IFN-γ等炎症因子,说明TLR9可能参与了TAO活动期眼眶炎症反应过程。