肾间质纤维化(RIF)是各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭(ESRD)的主要病理基础和共同途径，RIF的程度是预测肾脏病慢性进展速度的独立因素。研究证明，肾间质成纤维细胞活化增殖是导致细胞外基质(ECM)合成增加和大量积聚的主要原因，在肾脏纤维化的发生发展过程中发挥极其重要的作用。因此，研究肾间质成纤维细胞活化增殖的调控机制，探索肾脏纤维化的防治措施，有助于延缓慢性肾脏病的进展，为开发治疗肾脏纤维化的新途径奠定科学依据。HSP72(HSP72)是一种细胞保护性蛋白，由2个主要的功能结构域参与分子伴侣的作用：C端的多肽结合区(PBD)，负责底物的结合和折叠；核定位序列(NLS)，决定HSP72在应激状态下的核聚集。我们前期的研究证明，HSP72可抑制EMT，延缓肾脏纤维化进程。其他学者则发现，加热诱导大鼠高表达HSP72能抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对心房成纤维细胞的激活和延缓心房纤维化。然而，关于HSP72调控EMT的分子机制，以及能否直接抑制肾间质成纤维细胞的活化和功能，目前尚不清楚。因此，本研究针对以上问题进行了如下探讨。　　 ㈠HSP72调控EMT的分子机制。　　 (1)体外研究。　　 目的：探讨HSP72对TGF-β/Smads信号通路的调控作用，揭示HSP72抑制EMT的分子机制。　　 方法：10ng/ml TGF-β1刺激肾小管上皮细胞株(NRK-52E)48小时，建立EMT模型。质粒转染细胞和RNA干扰，分别上调野生型HSP72(Wt-HSP72)或变异型HSP72(HSP72-△PBD和HSP72-△NLS)表达和下调HSP72表达。以Western印迹检测E-cadherin，α-SMA的表达和Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad7的蛋白含量；间接免疫荧光观察HSP72和Smad3/p-Smad3的细胞定位；联合免疫沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)分析HSP72与Smad3之间的相互作用。　　 结果：TGF-β1能诱导NRK-52E细胞的E-cadherin表达下调和α-SMA表达上调；特异性高表达HSP72或HSP72-△NLS均可明显减轻TGF-β1介导的EMT现象，特异性下调HSP72表达则加重TGF-β1诱导EMT，而HSP72-△PBD不能抑制TGF-β1诱导的EMT。Western-blot结果显示，TGF-β1刺激使p-Smad2和p-Smad3呈时间依赖性升高；HSP72或HSP72-△NLS过表达能明显降低各时间点p-Smad3的水平，以及细胞核内p-Smad3的聚集，而HSP72-△PBD过表达不能阻抑Smad3的活化和核易位。免疫荧光和激光共聚焦结果进一步证实，HSP72能减少Smad3/p-Smad3在细胞核的聚集。过表达野生型和变异型HSP72均使Smad7蛋白含量增加，但不影响Smad2的磷酸化。Co-IP结果显示，HSP72与Smad3/p-Smad3均存在相互作用，而且随着HSP72的表达增高，HSP72与Smad3的结合增加；HSP72-△NLS仅在细胞浆与Smad3结合；HSP72-△PBD则完全不能与Smad3相互作用。　　 (2)体内研究。　　 目的：探讨大鼠UUO模型中HSP72对EMT相关的Smads蛋白的影响。　　 方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组，开腹不结扎输尿管)、单侧输尿管梗阻模型组(UUO模型组，开腹后结扎右侧输尿管)和GGA干预组。每组各6只大鼠。建立模型前1天开始，GGA干预组和模型组分别给予400mg/kg GGA和溶媒(0.05％阿拉伯树胶+0.008％维生素E)灌胃，每天1次。术后第7天处死大鼠，并留取右侧肾组织。Western blot和免疫荧光染色检测HSP72和Smads蛋白的表达。　　 结果：Western-blot显示，UU0模型组肾脏组织p-Smad2和p-Smad3水平明显升高，Smad7蛋白水平显著下降；GGA可特异性诱导大鼠肾脏HSP72高表达，抑制p-Smad3，刺激Smad7上调表达，但不影响p-Smad2的水平。免疫荧光显示p-Smad3主要分布在肾小管上皮细胞的细胞核内，GGA可显著减少p-Smad3的表达。　　 小结：①HSP72可显著抑制TGF-β1诱导的EMT。②HSP72通过与Smad3/p-Smad3结合，降低TGF-β1介导的p-Smad3水平，减少p-Smad3的细胞核易位，从而阻止EMT的发生和发展。HSP72的PBD功能域是HSP72发挥上述保护作用的必要分子结构。但是HSP72不影响Smad2的磷酸化。③HSP72稳定TGF-β1作用下Smad7的蛋白水平。④GGA可特异性诱导肾脏组织HSP72高表达，显著抑制UUO模型Smad3磷酸化，并明显增加Smad7蛋白含量，但对Smad2活化没有抑制作用。　　 ㈡HSP72对肾间质成纤维细胞活化增殖的影响及其分子机制。　　 (1)体外研究。　　 目的：探讨HSP72对肾脏成纤维细胞活化增殖和功能异常的影响及机制。　　 方法：2ng/ml TGF-β1刺激肾间质成纤维细胞株(NRK-49F)24小时，诱导其活化和增殖。质粒转染和RNA干扰方法分别上调和下调细胞HSP72的蛋白水平。以Western印迹检测α-SMA，Fibronectin，CollagenⅠ和CollagenⅢ的含量。相差显微镜观察细胞形态学改变，细胞计数观察细胞增殖情况，BrdU吸收率检测细胞DNA合成情况，MTT检测细胞活力，流式细胞仪评估细胞凋亡的发生率，侵袭力实验分析细胞迁移力。Western blot检测PCNA，Bcl-xl，Bcl-2，Survivin，Bax蛋白的表达；流式细胞仪检测细胞周期的分布和变化。Western blot和免疫荧光染色分别检测Stat3活化情况和细胞内分布。Co-IP检测HSP72与Stat3相互作用。转染含Stat3反应元件的荧光素酶报告质粒检测Stat3转录活性。　　 结果：TGF-β1呈剂量及时间依赖性诱导NRK-49F细胞表型改变和形态学变化，阻止细胞增殖，减少细胞外基质的产生和降低细胞的迁移力。HSP72通过抑制细胞活力和DNA合成，减少PCNA，Survivin和Bcl-xl蛋白的表达，阻抑TGF-β1介导的NRK-49F细胞增殖。流式细胞仪检测结果显示，HSP72不能抑制NRK-49F细胞的凋亡，但是HSP72使TGF-β1作用下NRK-49F细胞周期分布发生显著变化，细胞主要停滞于G1期，并分别下调和上调细胞周期蛋白CyclinD1和p21的含量。Westem blot和免疫荧光结果显示，HSP72高表达可显著抑制TGF-β1作用下的Stat3活化和核易位。荧光素酶报告基因证明，HSP72能降低Stat3转录活性。Co-IP实验发现，HSP72与Stat3之间存在相互作用，且HSP72高表达时该作用明显增强。　　 (2)体内研究。　　 目的：探讨HSP72对肾脏组织Stat3蛋白表达以及活化的影响。　　 方法：应用GGA特异性诱导HSP72在肾脏高表达，或GGA给药前2小时腹腔注射槲皮素Quercetin(100mg/kg)。建立大鼠UUO模型，7天后处死大鼠留取肾组织标本，Western blot和间接免疫荧光检测α-SMA，Fibronectin，CollagenⅠ蛋白表达和Stat3活化情况；Picrosirius Red染色检测组织中胶原蛋白含量。　　 结果：大鼠UUO7天时，肾脏组织α-SMA，Fibronectin，CollagenⅠ和CollagenⅢ蛋白表达明显增多，磷酸化Stat3(p-Stat3)水平显著增加。免疫荧光结果显示，p-Stat3主要分布在肾脏实质细胞核内。GGA诱导肾脏HSP72高表达，可显著抑制α-SMA，Fibronectin的表达和胶原蛋白的含量，以及p-Stat3水平和细胞核易位；槲皮素抑制GGA诱导的HSP72蛋白表达水平，并消除GGA阻抑Stat3活化和肾脏纤维化的保护作用。　　 小结：①HSP72可显著抑制TGF-β1作用下成纤维细胞的活化增殖和功能。②HSP72降低TGF-β1诱导成纤维细胞的Cyclin D1表达水平，升高p21的表达，抑制DNA合成，使细胞停滞于G1期，从而阻抑细胞增殖。③HSP72通过抑制TGF-β1作用下成纤维细胞Stat3的活化水平、p-Stat3细胞核易位以及降低Stat3的转录活性，阻止Stat3介导的细胞增殖和存活。④GGA诱导HSP72高表达可显著降低大鼠UUO模型肾组织p-Stat3水平和细胞核易位，抑制肾间质纤维化的程度。　　 结论：　　 ⑴HSP72通过抑制肾小管上皮细胞Smad3的磷酸化，p-Smad3细胞核易位，以及上调Smad7，调控TGF-β/Smads信号通路介导的EMT。　　 ⑵HSP72的PBD结构域是HSP72发挥抗EMT作用的关键功能域。　　 ⑶HSP72通过抑制成纤维细胞Stat3的活化水平、p-Stat3细胞核易位以及降低Stat3的转录活性，阻止Stat3介导的细胞增殖、存活和细胞侵袭力。　　 ⑷HSP72发挥抗肾脏纤维化的效应可通过抑制EMT和成纤维细胞活化增殖两种途径实现。