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研究背景血管钙化(VascularCalcification,VC)是动脉粥样硬化、糖尿病及慢性肾病等重大疾病的重要并发症,是危害人类健康疾病的独立危险因子。目前的研究显示,动脉钙化是一种细胞主动性的成骨分化过程,而血管平滑肌细胞(Smooth Muscle Cells,SMCs)在此过程中扮演着最重要的角色。尽管目前对血管钙化的机制研究有一定的了解,然而仍旧缺乏有效的干预血管钙化进展的药物。实验目的本实验拟研究促生长激素释放激素激动剂(Agonist of growth hormone-releasing hormone,GHRH-A,即MR409)抑制平滑肌细胞体外钙化及骨保护素敲除小鼠(osteoprotegerindeficient,OPG-/-)血管钙化作用及其潜在的机制。实验方法分离扩增血管平滑肌细胞,通过免疫荧光及免疫印迹技术明确平滑肌细胞中促生长激素释放激素受体的表达模式。同时,在体外成骨诱导环境下,通过钙化染色,钙离子含量、成骨相关转录因子Runx2表达量、碱性磷酸酶活性等指标,明确MR409在平滑肌细胞钙化过程中的作用。OPG-/-小鼠可产生自发血管钙化,连续4周皮下注射MR409,收集主动脉行微型CT扫描,病理切片行钙结节染色,检测钙、磷、碱性磷酸酶等指标,收集血清,检测血磷、血钙等,明确MR409对血管钙化的作用。通过mRNA测序,了解MR409抑制SMCs钙化的机制。实验结果我们发现GHRH受体及其剪切变异体表达于平滑肌细胞表面。在含有10mM的β-磷酸甘油的钙化诱导培养基中,MR409的添加可显著抑制平滑肌细胞的钙化,表现为:茜素红染色显著减少,总钙含量降低,碱性磷酸酶活性减弱。同时,成骨相关转录因子Runx2的表达在mRNA及蛋白水平都显著降低,碱性磷酸酶活性减弱,而该抑制作用可被MR409的竞争性拮抗剂MIA602部分阻断。为了明确MR409抑制平滑肌细胞钙化的机制,平滑肌细胞经MR409处理后行转录组测序,结果显示,MR409可以显著抑制NADPH氧化酶表达,提示MR409参与氧化应激过程。进一步的研究显示,MR409可以显著增加细胞内环磷酸腺苷(cAMP)含量,抑制NADPH氧化酶活性,从而抑制高磷诱导的平滑肌细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)增加。此外,MR409可以减少高磷诱导的平滑肌细胞钙内流。体内实验显示,OPG-/-小鼠给予MR409皮下注射4周后,微型CT显示主动脉钙化程度减轻,动脉病理切片茜素红染色显示阳性面积占主动脉总面积的比例减少。此外,主动脉中钙磷含量、碱性磷酸酶活性均在MR409干预组中降低。然而,MR409干预并不能降低OPG-/-小鼠血清中血磷、血钙水平及碱性磷酸酶活性。实验结论MR409主要通过激活cAMP/PKA信号通路,抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS产生,从而减少Runx2的表达及ALP活性,抑制血管钙化的发生及发展。