目的:皮肤组织创伤是临床及生活中的常见问题，可以由外伤因素，如机械性外伤、烧烫伤、手术等因素，或者全身性疾病如糖尿病所致皮肤受损等引起。皮肤创伤愈合是皮肤受损后机体进行的主动的复杂而有序的病理生理学修复过程。皮肤受损后通过一系列复杂的生理学事件，如凝血，炎症反应，细胞增殖分化，组织重塑[1]，伴随着多种细胞因子生长因子以及酶类的参与，这些过程相互重叠又有序进行。瘢痕组织形成是成体皮肤创伤愈合的终末状态，成熟的瘢痕组织是狭小的，平整的并色素沉着浅的[2]，而过度的瘢痕组织形成则由于张力应力及胶原沉积排列有别于正常组织致使组织器官的正常生理功能受到影响，皮肤的过度瘢痕组织还存在着会影响外观的可能性。因此，众多科研人员都在致力于寻求可以减少皮肤瘢痕形成的有效治疗措施。　　无瘢痕创伤愈合的概念首次由Burrington于1971年提出，Burrington发现胚胎皮肤创伤愈合后没有瘢痕组织学表现[3]，引发了人们对胚胎皮肤无瘢痕愈合机制的研究。无瘢痕的现象只出现在妊娠的早期阶段[4]，之后过渡为少瘢痕期和瘢痕期。组织创伤后的瘢痕修复，既影响功能又影响美观，是多年来困扰广大医患人员的难题。妊娠早期胎儿皮肤由于其细胞的固有特性[5]，如低炎症反应，特有的成纤维细胞表型，特有的基因型表达，最终达到无瘢痕愈合的状态，妊娠早期胚胎皮肤创伤后的这种无瘢痕愈合，为人们提供了一个理想的组织修复模型，也同时为研究皮肤无瘢痕愈合提供了新的平台。　　微小RNA(microRNA、miRNA)作为内源性微小RNA，是一类近年来发现的广泛存在于真核生物中的非编码小分子RNA[6]。由21-23个核苷酸分子组成，从基因组DNA转录而来，通过miRNA自身的种子序列（从5端开始的第2-8位核苷酸序列）与靶基因的3UTR反向互补结合，形成RNA沉默复合体（RISC），从而介导靶蛋白的翻译合成抑制或使其降解，miRNA参与调控个体发育，细胞增殖，分化及凋亡等多个生物学过程。但是miRNA在皮肤创伤愈合过程中的作用机制尚未完全明了，急需发现更加有效的miRNA来促进皮肤创伤愈合过程。在本研究中，我们探讨了已知的miR-149和测序新发现的miRNA seq-915。文献表明miR-149可以在骨关节炎及巨噬细胞中充当免疫调节因子的作用[7，8]，结合前期测序结果，推测miR-149也可以在皮肤创伤愈合过程中的炎症反应发挥一定作用。同时，我们将在测序中新发现的，未被报道和验证过的miRNA称之为“新 miRNA”，而“seq-”表示在测序中我们对新发现的miRNA所进行的暂时性命名。seq-915作为新发现的miRNA，通过前期分析推测，其与皮肤创伤愈合过程中的炎症反应也具有一定相关性。　　炎症反应作为皮肤创伤愈合过程中的必经阶段，炎症反应程度和炎症反应时间在皮肤创伤愈合过程中起着至关重要的作用。胎儿皮肤具有低炎症反应，较少促炎性因子分泌，较高水平抗炎性因子分泌和较少炎性细胞浸润的特点[5]。当炎症反应过于强烈或者转为慢性炎症，都是瘢痕形成的重要影响因素之一。只有当多种炎性细胞与炎性因子相互协调，达到一个相对平衡适度的水平，才会使炎症反应在创伤愈合过程中最大程度的展现它的优势作用。目前，我们对miRNA在炎症阶段的作用机制尚未完全明朗。创伤发生后，中性粒细胞和淋巴细胞通过受损血管向创伤处浸润，随后，免疫细胞释放趋化因子和细胞因子，如PDGF，血小板因子Ⅳ，TGF-β和TNFα等[9]。白细胞介素作为炎性介质，是参与炎症反应和创伤后修复过程的重要炎性因子，其中包括促进肉芽组织形成，阻碍再上皮化和组织重塑等。白细胞介素通过直接或间接的方式影响创伤愈合，同时具有一定的时间相关性与浓度依赖性，并且白介素家族的成员间也彼此作用，形成复杂的调控网络。　　研究表明，在正常和创伤皮肤中miRNA的表达具有显著的差异性。研究人员对损伤不同时间阶段人创伤处皮肤进行高通量分析[10]，结果显示出在创伤后0h和24h的创伤处皮肤中，很多miRNA存在显著表达差异。通过进一步的生物信息学分析，研究人员得出差异表达的miRNA对多个靶基因以及多个传导通路具有显著的调控作用。这些miRNA能够通过调控炎症反应过程而在皮肤创伤无瘢痕愈合过程中发挥作用。　　人胚胎皮肤发育过程中也伴随着基因的选择性表达，使得胎儿皮肤具有其低炎症反应等一系列固有特点[11-13]，那么在孕中晚期创伤愈合形成瘢痕与否的转变是否是伴随着基因表达发生转变的结果？也就是说人孕中、晚期胎儿皮肤中miRNA的表达不同是否影响无瘢痕愈合的机制还不清楚。因此，在本研究中，我们通过检测人孕中、晚期胎儿皮肤角质形成细胞中miRNA的表达情况，来探究人皮肤角质形成细胞中差异表达的miRNA对皮肤创伤无瘢痕修复的作用机制。　　方法:　　一、孕中期与孕晚期人胎儿皮肤角质形成细胞中miR-149和新miRNA seq-915的差异表达和靶基因验证　　1、通过比对及生物信息学分析，从前期筛选到的具有差异表达的miRNA数据中，筛选得到与炎症有关的新miRNA和已知miRNA。　　2、通过实时荧光定量qRT-PCR技术验证测序得到的miRNA的相对表达结果。　　3、应用生物信息学分析预测miR-149和新miRNA seq-915可能作用的靶基因。　　4、构建含有miR-149和新miRNA seq-915靶基因的3UTR的荧光素酶报告基因载体。　　5、应用荧光素酶报告基因检测技术检测miR-149和新miRNA seq-915在HaCaT细胞中对各自相应靶基因的调控作用。　　二、miR-149和新miRNA seq-915调节角质形成细胞和成纤维细胞中的炎症反应促进皮肤创伤无瘢痕修复的研究　　1、通过脂质体转染技术构建过表达miR-149和新miRNA seq-915的人皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞。　　2、通过MTS增殖实验检测过表达miR-149后HaCaT细胞的增殖能力。　　3、通过Transwell迁移实验检测过表达miR-149后HaCaT细胞的迁移能力。　　4、将构建好的过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞与人皮肤成纤维细胞进行Transwell共培养。　　5、通过实时荧光定量qRT-PCR技术检测在炎症条件下miR-149和新miRNAseq-915的表达改变情况。　　6、通过实时荧光定量qRT-PCR技术检测过表达miR-149和新miRNAseq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关因子的mRNA水平表达情况。　　7、通过ELISA技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关分泌蛋白水平表达情况。　　8、通过western blot技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下炎性相关蛋白表达情况。　　9、通过western blot技术检测过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞在正常和炎症条件下对NF-κB通路的影响情况。　　10、通过实时荧光定量qRT-PCR及western blot技术检测与过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞共培养的成纤维细胞中无瘢痕愈合相关基因的表达改变情况。　　三、miR-149和新miRNA seq-915调节皮肤创伤炎症反应促进无瘢痕修复的研究　　1、制作wistar大鼠背部全层皮肤圆形直径1cm的皮肤缺损模型。　　2、通过Nunc UpCell培养表面技术获取过表达miR-149和新miRNA seq-915的HaCaT细胞层。　　3、将获取到的HaCaT细胞层作用于大鼠背部全层皮肤缺损的创面，并被覆以水凝胶、纱布、绷带，用来固定创面。　　4、在第1、3和28天切取皮肤创面组织，拍照观察皮肤创伤愈合速度。　　5、OCT包埋后，进行冰冻切片，HE和masson染色，免疫荧光染色检测中性粒细胞表面标志物Ly6G和巨噬细胞表面标志物F4/80，免疫组化染色检测成肌纤维细胞表面标志物αSMA。　　结果:　　一、分析得到在孕中期比孕晚期中人胎儿皮肤角质形成细胞中高表达的miRNA:miR-149和新miRNA seq-915　　1、发现人胎儿皮肤角质形成细胞在孕中期比孕晚期高表达的miRNA，其中miR-149和新miRNA seq-915验证结果最理想。　　2、预测新miRNA seq-915与炎症相关。　　3、miR-149抑制角质形成细胞中IL-1α，IL-1β和IL-6的表达。　　4、新miRNA seq-915抑制角质形成细胞中IL-8和TNFα表达。　　二、人孕中期皮肤中高表达的miR-149和新miRNA seq-915抑制角质形成细胞系和成纤维细胞的炎症反应促进皮肤创伤无瘢痕修复。　　1、过表达miR-149显著促进HaCaT细胞的迁移能力。　　2、过表达miR-149对皮肤角质形成细胞的增殖能力没有显著影响。　　3、过表达miR-149和新miRNAseq-915抑制炎性相关因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα的表达。　　4、过表达miR-149和新miRNA seq-915促进无瘢痕愈合相关因子TGF-β3和collagenⅢ的表达。　　三、miR-149和新miRNA seq-915抑制皮肤创伤炎症反应促进无瘢痕修复　　1、miR-149和新miRNA seq-915可以减少炎性细胞浸润。　　2、miR-149和新miRNAseq-915可以使皮肤真皮层胶原排列更加规律整齐，呈网织状，更趋向于正常未受损的皮肤组织结构。　　3、miR-149和新miRNA seq-915作用的皮肤创伤处中性粒细胞表面标志物Ly6G，巨噬细胞表面标志物F4/80和成肌纤维细胞表面标志物αSMA表达均降低。　　结论:　　过表达miR-149和新miRNA seq-915抑制角质形成细胞中的炎症反应，促进皮肤创伤无瘢痕修复。