木质纤维素的有效利用为解决未来社会能源危机问题提供了可能的途径。多功能性的糖苷水解酶组分在生物资源转化过程中具有重要的应用价值。本论文主要优化了现有糖苷水解酶的高通量功能表征平台；并通过对多功能性糖苷水解酶组分GH12家族纤维素酶的催化机理进行阐释,一定程度上提高了对海量基因序列进行自动功能注释的准确度,同时为进一步理解糖苷水解酶结构和功能关系及对其多功能活性架构指明了方向。本论文开展的相关研究工作及主要成果如下1.优化了现有糖苷水解酶的活性电泳技术,结合数字图像处理技术,为高通量快速表征糖苷水解酶的功能与性质奠定了基础。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,将电泳后酶组分与底物的酶促动力学反应在凝胶中进行,建立了木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素内切酶和纤维素外切酶的活性电泳展示技术。通过数字图像处理技术对电泳条带的灰度值进行定量提取,并与其蛋白质浓度(或酶活性)的相关性进行分析,表明条带灰度值与其蛋白质浓度(或酶活性)具有线性正相关性。结合非变性凝胶电泳技术和数字图像处理技术,展示了不同酶组分的pH稳定性和温度稳定性；表明各酶组分在降解不溶性聚合物时具有明显的协同关系。在此基础上,通过对比非变性聚丙烯酰胺凝胶中对应蛋白条带相对迁移率的变化,快速分析了不同糖苷水解酶与其底物的结合力。本文建立的糖苷水解酶性质表征技术,不仅可以更方便地展示天然生境条件下各酶组分的多样性和其固有反应特性,还可应用于糖苷水解酶工程改造后的快速筛选过程。因此,该技术的建立具有重要的应用价值和实践意义。2.阐明了糖苷水解酶GH12家族活性架构中的功能决定性氨基酸残基,实现了其酶组分功能的理性转变从系统生物学角度对糖苷水解酶GH12家族的进化历史、序列、结构和功能进行了分析,构建了该家族的系统发育树。在此基础上通过对直接参与底物结合的活性架构区域进行序列和结构比对,快速定位了其功能决定性氨基酸残基。以瑞氏木霉Trichoderma reesei QM9414和黑曲霉Aspergillus niger CBS120.49的GH12家族纤维素酶EGⅢ和EglA为研究对象，对其活性架构进行了分析。分析表明，纤维素酶组分EGⅢ中的催化残基E116和E200在整个GH12家族中绝对保守，其分别通过侧链基团的羧基催化糖苷键的断裂；N95位氨基酸残基因能与酸碱催化基因E200形成氢键，对整个GH12家族酶分子的最适pH产生影响；W22位氨基酸残基与-2位糖环间形成的C-H...π作用力在酶分子识别和结合不同底物分子过程中发挥重要作用，是该酶分子多功能性的物质与结构基础。将EGⅢ的N95位氨基酸进行天冬氨酸(D)的突变，最适pH向酸性方向偏移了0.6个pH单位；突变体W22Y降解pNPC等小分子的活力约分别为其野生型的33.8%(EGⅢ)和468%(EglA);同时发现其明显提高了对纤维素类底物的结合力，具有了一定的持续性降解能力；荧光辅助糖电泳(FACE)检测结果表明，突变体W22H对磷酸膨胀纤维素(PASC)降解后的产物中含有大量纤维四糖，为纤维素酶的有效诱导提供了寡糖来源。另外，本研究还证实，纤维素酶活性的高低是底物结合与产物释放的平衡过程。对结合特异性决定位点进行的理性突变，可实现其酶学功能的快速转变；而对催化残基周围的关键氨基酸进行的突变，则可一定程度上改变其酶学性质。这为通过蛋白自质工程改造更多具有优良反应特性的糖苷水解酶类提供了理性指导。3.阐明了GH12家族酶组分多功能性的催化机理通过对GH12家族纤维素酶组分与不同底物结合形成的复合物进行结构分析研究发现，纤维素酶功能多样的结构基础在于其功能决定性氨基酸残基与不同底物配体共有结构间的部分识别。X光多品粉末衍时(XRD)测定结果表明，GH12家族纤维素酶组分作用后的CF11结晶度降低，表明其能一定程度上破坏纤维素的有序结构。采用原子力显微镜(AFM)对纤维素酶作用后的CF11切面结构中的微纤丝直径进行统计，发现其最外层微纤丝明显比其内部微纤丝直径大。根据该家族酶分子结合特异性决定位点的特殊架构，一定程度上阐明了其在微纤丝上的特有结合模式及其类似’Expansin’的活性。多功能性催化机理的阐释为高效降解纤维素酶系的人工复配或重构指明了方向。总之，我们建立了一种以蛋白质家族为对象、对其活性架构进行研究以快速定位其功能决定性氮氨基酸残基的方法。对活性基因的架构似研究，为阐明其催化机理、提高自动功能注释的准确度及实现功能的快速转变和理新指导分子的工程化改造指明了方向：同时,高通量蛋白质功能表征平台的建立对充分展示酶分子的多样性及快速筛选优良突变体都具有重要意义。