家蚕是鳞翅目昆虫的模式种,家蚕基因组全序列完成后,有关家蚕功能基因组学、发育与变态、性别决定、丝蛋白的高效合成、天然免疫等机制研究取得巨大进展,但有关家蚕肠道菌群结构的研究相对较少。动物肠道中栖居着大量的微生物,肠道微生物在对食物的消化和营养的吸收过程中起非常重要的作用。早期研究者通过传统的纯培养的方法对家蚕肠道微生物做了初步的研究;随着对分子生物学技术的进步,有学者利用细菌16S rRNA基因的通用引物,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法对家蚕肠道菌群做进一步研究。由于自然界绝大多数菌难以人工培养,DGGE法也存在缺陷,不能全面深入地检测出家蚕肠道微生物。近年来,高通量测序技术已成为研究肠道微生物种群的关键技术,因此本研究利用高通量测序技术调查家蚕肠道细菌的多样性及丰度,希望为更全面地理解肠道微生物与家蚕间的相互关系提供新的数据。家蚕肠道菌群结构受性别、发育、饲料及环境等多种因素的影响,肠道微生物的失衡,往往导致肠道细菌性疾病的发生,同时诱导家蚕产生免疫响应,并引起免疫通路相关基因及抗菌肽基因的表达发生相应的改变,反过来又影响肠道菌群的结构和组成。为了探讨家蚕肠道微生物菌群对病毒感染、高温处理的响应规律,解析肠道微生物与病毒感染、家蚕免疫通路基因表达间的互作,分析家蚕进化过程中肠道微生物的变化,本研究分别调查了家蚕质型多角体病毒(BmCPV)、家蚕浓核病毒(BmBDV)感染以及高温刺激对五龄家蚕肠道细菌种群的变化,分析了家蚕肠道细菌之间的互作,初步研究了家蚕肠道菌群变化与病毒感染、高温刺激、家蚕基因表达之间的相互关系,并研究了家蚕与野桑蚕肠道细菌种群的差异。相关研究结果为全面理解家蚕肠道微生物提供了新的数据。1.BmCPV感染对家蚕肠道菌群的影响为了调查正常家蚕肠道菌群的结构组成及感染BmCPV后的变化,按感染病毒后正常饲养24h,72h和144h三个时间点收集五龄家蚕肠道内容物,根据16S rRNA基因的焦磷酸测序数据分析各感染时期的肠道细菌的组成和丰度。结果显示,在正常雌性和雄性家蚕肠道中分别发现147和135个细菌属,在感染BmCPV雌性和雄性家蚕肠道中分别发现113和103个细菌属。总体来讲,感染BmCPV以后,家蚕肠道细菌多样性明显降低,但是属于革兰氏阳性菌的肠球菌属(enterococcus)和葡萄球菌属(staphylococcus)的丰度增加,推测感染bmcpv后的这种细菌属丰度的变化与家蚕的免疫系统反应有关。优势菌属的丰度相关性分析结果显示,肠球菌属的丰度与其它的优势菌属成负相关。2.bmbdv感染对家蚕肠道菌群的影响为了探讨bmbdv感染对家蚕肠道菌群的影响及可能的作用机制,五龄起蚕人工感染bmbdv后,按感染病毒后正常饲养48h,96h,144h三个时间点收集感染家蚕及正常家蚕的中肠内容物及中肠,利用16srrna基因的illuminamiseqsequencing数据对肠道菌群进行分析。结果显示,bmbdv感染家蚕肠道中菌群结构与对照家蚕差异较大,菌群多样性在感染后正常饲养48h、96h变化不大,而144h明显低于正常家蚕。感染bmbdv后,肠球菌属比例逐渐增加,分类不明菌属incertae_sedis的比例在感染后96h时达到最高,乳球菌属(lactococcus)的比例减少。主成分分析结果显示,肠球菌丰度与大部分优势细菌呈负相关,其中anderseniella、incertae_sedis、反硝化细菌(simplicispira)及肠球菌属丰度增加很可能与感染bmbdv有关。荧光定量分析结果显示,bmbdv感染后期,免疫系统toll、imd和jak/stat通路相关基因表达量升高,同时诱导中肠抗菌肽(攻击素attacins,防御素defensin,天蚕素cecropins)的表达,感染后144h时肠道中的肠球菌属丰度增加与家蚕spatzle(bmspz)、肽聚糖识别蛋白(bmpgrp-le和bmpgrp-lb)基因表达量成正比,推测bmbdv感染导致肠球菌丰度增加,进而激活toll及imd通路。3.短暂高温处理对家蚕肠道菌群的影响有关高温对家蚕肠道微生物种群、基因表达的影响研究较少。本研究利用16srrna基因的高通量测序技术研究了短暂高温处理(37?c,8h)后正常饲养48、96、144h的家蚕肠道细菌种群结构,同时用qpcr检测了家蚕免疫信号通路重要基因表达水平。结果显示,高温处理的家蚕肠道细菌多样性增加,肠球菌属、泛菌属(pantoea)、incertae_sedis、escherichia-shigella、anderseniella和不动杆菌属(acinetobacter)的丰度变化幅度较大,表明它们对高温处理较敏感。pca分析显示,肠球菌属与葡萄球菌属的丰度与其它优势菌成负相关。物种-宿主基因表达矩阵分析结果显示,在健康家蚕样品中bmspz表达水平与肠球菌属和葡萄球菌属的丰度成负相关,与其它优势菌成正相关(除贪食菌属(variovorax)外)),dicer-2基因(Bmdrc-2)的表达水平与肠球菌属和葡萄球菌属丰度成正相关;在高温处理的家蚕样品中,贪食菌属的丰度与Bmspz表达水平成正相关,肠球菌属、Escherichia-Shigella、Incertae_Sedis、Anderseniella、不动杆菌属的丰度与Bmspz表达水平成负相关,与Bmdrc-2、BmPGRP-LE、BmPGRP-LB成正相关。这些结果为理解高温-家蚕肠道细菌-家蚕基因表达间的关系提供了新的线索。4.野蚕肠道菌群结构野桑蚕(Bombyx mandarina Leech)是家蚕的祖先,为了分析家蚕驯化对肠道微生物种群的影响,本研究对野桑蚕/家蚕五龄后期肠道细菌进行了16S rRNA基因的高通量测序,结果显示,野桑蚕中肠球菌属的丰度(69.73%)明显高于家蚕(48.99%),罕见菌属(Advenella)在野蚕肠道细菌的比例为11.54%,而在家蚕中没有检测到;乳球菌属(Lactococcus),芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)在正常家蚕肠道细菌的占比分别为17.73%、5.02%和1.61%,而野桑蚕中的比例明显低于家蚕,分别为0.15%、0.54%和0.45%。表明肠道细菌的结构家蚕与野桑蚕间存在明显差异,人工驯化也可影响肠道细菌的种群,而肠道细菌的这些差异也许与野蚕对环境的适应性、摄食性优于家蚕有关。