绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种条件致病的革兰氏阴性菌,其广泛存在于自然界中,可以感染动植物及人类。在人的免疫力低下时容易被感染,容易引起慢性或急性疾病,同时绿脓杆菌提高囊性纤维化患者的发病率和死亡率。由于其内在具有较强的抗药性和获得性抗药性,药物治疗已经越来越难治愈其引起的疾病。绿脓杆菌的Ⅲ型分泌系统（TypeⅢSecretion System,T3SS）主要造成急性感染,是主要致病因子之一。T3SS的构造类似于针状结构,它由四部分不同功能的蛋白复合物组成（包括分泌装置、转运装置、效应蛋白和相应的分子伴侣）,并通过它与寄主相连把效应蛋白注入到寄主中导致寄主感病。目前绿脓杆菌的T3SS具体的调控网络还不清楚,但已知约有43个基因能调控T3SS。其内在调节因子如双组分系统、Crc、Vfr、RNA解旋酶Dea D和Fis等通过调控exs A进而调控T3SS。在一定的外在条件或环境因子下T3SS可被诱导表达,例如低钙条件、血清、和寄主接触,还有群体感应信号rhl、PQS和其他小分子乙酰辅酶A、组氨酸、亚精胺等都可以影响T3SS基因的表达。因此研究与Ⅲ型分泌系统的相关基因及其调控体系具有重要的应用前景和意义。本课题重点对与T3SS有关的基因进行研究,主要工作如下:根据前人筛选结果,选取PA2768、PA3598、PA3218、PA0317这4个可能对T3SS有调控作用的基因进行敲除。在敲除工作中分别利用绿脓杆菌野生型菌株PAO1和T3SS报告菌株PCZ为母体构建了上述4个基因的两类突变体。为了研究这些基因是否对绿脓杆菌中一些依赖于群体感应系统的重要毒力因子有调控作用,用构建好的突变体和野生型做生长曲线、弹性蛋白酶、绿脓菌素、运动性和生物膜等表型实验。表型实验结果表明,PA2768、PA3598、PA3218、PA0317突变体相较于野生型不影响细菌的生长,不影响弹性蛋白酶、生物膜和绿脓菌素的产量,不影响细菌的运动性。为了研究以上4个基因是否对T3SS有调控作用,用在报告菌株上敲掉的突变体进行β-半乳糖甘酶实验,实验结果表明,PA2768突变体相较于野生型半乳糖甘酶产量下降50%左右,差异显著,功能互补后PA2768突变体半乳糖甘酶产量恢复至野生型水平。为了进一步验证PA2768基因对T3SS的调控作用,在转录水平上对野生型、互补体和突变体中研究T3SS的主要调控基因exs A及其效应蛋白基因exo S、exo Y和exo T的表达量。实验结果表明PA2768对exs A、exo S、exo Y和exo T基因的表达均有明显下降。突变体功能互补后exs A及T3SS效应蛋白基因的表达量能恢复至野生型水平。在翻译水平上敲除PA2768基因导致exs A表达量明显下降,细胞毒力实验中PA2768突变降低了对细胞的毒力,这些结果表明了该基因对绿脓杆菌T3SS的调控作用。本研究发现了新的对Ⅲ型分泌系统有影响的基因,该结果有助于阐明绿脓杆菌Ⅲ型分泌系统的复杂调控网络,并可能为未来解决绿脓杆菌感染和临床治疗难题及新药物的研发提供新的思路。