丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为我国传统中药,始载于《神农本草经》,列为上品。丹参具有活血调经,祛瘀止痛,凉血消痈,清心除烦及养血安神的作用。丹参中脂溶性二萜——丹参酮类化合物的生物合成是目前研究的热点。课题组前期克隆得到了一条丹参柯巴基焦磷酸和酶(SmCPS)全长基因,并通过异源表达获得SmCPS蛋白,建立体外酶促反应体系,通过分析酶促反应产物鉴定基因的功能,催化二萜类共同前体物质GGPP形成柯巴基焦磷酸(CPP),为丹参二萜类生物合成途径关键酶基因,参与丹参酮的生物合成。然而SmCPS在植物体内的调控机制仍不清楚,此外近期的丹参转录组深测序结果表明,柯巴基焦磷酸合酶基因可能存在多条,blast比对发现其中一条基因片段与多种植物来源的ent-CPS基因的同源性较大,可能催化GGPP形成ent-CPP而参与植物生长激素——赤霉素的生物合成。基于以上认识,本实验拟从丹参毛状根中克隆得到ent-CPS全长基因并构建SmCPS和ent-CPS体内干扰表达载体,探讨二萜和酶基因沉默对丹参酮积累的影响；此外,通过引入外源诱导子促使SmCPS和ent-CPS高表达,进一步探讨CPS基因家族对丹参酮次生代谢的影响。具体研究包括以下几个方面：1. ent-CPS基因全长克隆在深测序得到一条ent-CPS基因片段的基础上,本研究采用快速cDNA末端扩增(RACE)的方法,在基因片段上分别设计5’和3’方向扩增的引物,并从丹参毛状根中提取RNA,合成第一链cDNA,之后采用RACE扩增,最终测序后分别得到5’端和3’端的扩增片段,将5’和3’端进行电子拼接,最终得到了ent-CPS的全长基因,全长为2379bp,基因编码区共编码792个氨基酸的蛋白,预测成熟蛋白的分子量(MW)为89.9kDa,等电点为6.47.对ent-CPS的保守结构域分析发现,ent-CPS具有N端结构域。ent-CPS核苷酸的系统发生数表明ent-CPS与丹参中已克隆出的两条SmCPS距离较远,推测ent-CPS可能是不同于参与丹参酮次生代谢的CPS基因,而可能是参与赤霉素等其他二萜次生代谢产物生物合成的二萜合酶。2. SmCPS, ent-CPS基因沉默对丹参酮类化合物的影响本实验在SmCPS全长和ent-CPS片段的基础上设计21nt左右的引物,采用Gateway技术,及在SmCPS和ent-CPS引物两端加入attB序列,分别通过BP和LR反应构建SmCPS和ent-CPS的干扰表达载体,通过农杆菌介导的方法获得丹参毛状根的转基因株系,以期考查二萜合酶基因在丹参毛状根中表达沉默后,丹参毛状根的表观、丹参酮类化合物的含量以及相关的基因表达是否发生变化,从而进一步验证ent-CPS及SmCPS基因的体内功能和调控机制。3.诱导子体外诱导表达对二萜合酶及丹参酮积累的影响本实验系统探讨了银离子(Ag+)、酵母提取物(YE)、茉莉酸甲酯(MJ)三类(非生物、生物、激素类)诱导子对丹参毛状根生长的不同时期丹参酮类次生代谢物及其二萜和酶的表达的影响,获得以下结果：诱导12h后,MJ诱导的作用最强,SmCPS的表达稍有上调,且主要表现为隐丹参酮的含量上调,诱导24h后,SmCPS的表达上调明显,各诱导组的丹参酮含量均表现为上调,且Ag和YE联合诱导的作用最强,Ag、YE单独诱导的作用次之,隐丹参酮和羟基丹参酮Ⅰ的增加量多于丹参酮ⅡA和丹参酮Ⅰ。诱导36h后,隐丹参酮的含量增加最明显且YA和YAM的诱导作用最强,YA和YAM诱导的SmCPS的表达最高。二萜合酶为丹参酮生物合成过程中的关键酶,其家族成员的功能分工直接影响着次生代谢物合成流向。本研究系统分析了体外诱导子对丹参二萜合酶及其丹参酮积累的影响,同时,家族基因ent-CPS的克隆及其SmCPS、ent-CPS的RNAi载体的构建、遗传转化为进一步探讨二萜合酶如何调控丹参酮的合成及丹参生长发育打下了良好基础。