【摘 要】
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近年来,工程酶的研发已由过去主要针对蛋白质骨架的修饰转向对酶的活性部位改进上。本研究以人溶菌酶（EC 3.2.1.17）为模型,通过合理设计构建“双中心”酶和“双功能”酶。人溶菌酶是一种重要的药用酶,已成为研究基因与蛋白质结构关系的经典模型。人溶菌酶基因包含四个外显子,其中外显子2为氨基酸28-82编码,包括催化中心的残基（Glu35和Asp53）,且Cys65-Cys81之间形成一段突环（loo
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近年来,工程酶的研发已由过去主要针对蛋白质骨架的修饰转向对酶的活性部位改进上。本研究以人溶菌酶（EC 3.2.1.17）为模型,通过合理设计构建“双中心”酶和“双功能”酶。人溶菌酶是一种重要的药用酶,已成为研究基因与蛋白质结构关系的经典模型。人溶菌酶基因包含四个外显子,其中外显子2为氨基酸28-82编码,包括催化中心的残基（Glu35和Asp53）,且Cys65-Cys81之间形成一段突环（loop）结构。我们将编码活性中心的外显子2重复嫁接到该突环中（Val74-Asn75密码间）,获得“双中心”溶菌酶HLY-E2基因,在大肠杆菌中表达后进行活性检测和稳定性分析。结果表明HLY-E2的相对活性是野生型人溶菌酶的211.5% ,且稳定性与野生型相似。利用定点突变并结合计算机模拟结果,证明HLY-E2确实存在两个活性中心。我们在对核酶的研究过程中发现锤头核酶能够编码具有催化活性的多肽,因此我们将由核酶编码的具有类似核酸酶活性的多肽称为核肽酶（ribopepzyme）。用同样方法将核肽酶的编码基因嫁接到溶菌酶的突环基因中,构建“双功能”酶基因,经诱导表达和纯化后获得“双功能”酶HLY-RD和HLY-2R。实验结果表明HLY-RD和HLY-2R同时具有溶菌酶的裂解活性和类核酸酶活性。因为自然界中大多数蛋白质（酶）都具有突环结构,所以工程原有突环为酶的新活性部位可能具有普遍意义。上述研究为获得“双中心”或“双功能”酶提供一条捷径。
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